几种抗菌中草药体外抗菌效果比较

邱 恒 张旭莹 王飔婷 侯 杨 张 浩

北京农业职业学院，北京102442

大肠杆菌病是禽类常见病，致病率和致死率都较高，一直困扰着我国禽类养殖业的健康发展，但随着我国禽类养殖业的迅速发展，抗生素的应用同样也越来越多、越来越广泛，对鸡大肠细菌产生抗药性的抗生素种类也越来越多，同时鸡大肠杆菌产生的耐药性问题也变得日趋严重。目前青霉素G 类对鸡大肠杆菌（青霉素G 的非耐菌率仅为0.85%）、大环内酯类（红霉素碱对鸡大肠杆菌非耐菌率仅为20.28%）、氨基糖苷类（链霉素对鸡大肠杆菌目前非耐菌率仅为51.12%、而庆大霉素对鸡大肠杆菌的非耐菌率为58.22%）、喹诺酮类（氧洛沙星对鸡大肠杆菌的非耐菌率为62.24%）非耐药性均较低。大肠杆菌的耐药性如若处理不当，将对禽类养殖业的治疗带来非常大的困难。所以要寻找新出路，拓宽治疗大肠杆菌病的治疗出路，而我国当前许多中草药，对鸡大肠杆菌具有比较好的抗菌和抑菌的重要作用。

本研究通过对大肠杆菌药敏试验，从中筛选出廉价且耐药性较低的中草药，同时对比抗生素类药物对大肠杆菌的抗菌效果，以研究中草药对大肠杆菌的抗菌性的可行性，为治疗对抗生素产生耐药性的大肠杆菌而引起的相关疾病找出路，并在一定程度上减少抗生素在一般禽类养殖业生产活动中的使用，避免耐药性大肠杆菌及其他耐药性致病菌的产生[1]。

常用抗菌中草药有：忍冬花、黄柏、蒲公英、板蓝根、黄连等，目前市场上多数为复方制剂，为选择效果明显的抗菌中草药，通过调查蛋鸡养殖户、兽药经营者和临床兽医，选择了5 种大家普遍认可的中草药处方制剂产品，进行了体外抑菌试验，从中选出抗菌效果比较好的中草药。

1 材料与方法

1.1 材 料

1）菌株及中草药。大肠杆菌（自备）、单味中草药5 种（板蓝根、黄柏、忍冬、蒲公英、黄连）、复方中草药制剂（板青败毒口服液，其有忍冬花、蒲公英、大青叶、白英、板蓝根。每100 mL 相当于原生药100 g。购于北京一家正规中药店），硫酸庆大霉素注射液，规格2 mL∶80 mg。购置华中药业股份有限公司。

2）培养基粉。麦康凯、普通营养琼脂、伊红美蓝和肉汤培养基均购于北京天坛生物制品股份有限公司。培养基的配制按标签说明完成。

3）试验设备。立式自动电热压力蒸汽灭菌器（LXB35L，合肥华泰医疗设备有限公司）、生物安全柜（BSC-1360IIA2，北京东联哈尔滨制造有限公司）、恒温鼓风干燥箱（2XFD-B5140，上海智联分析仪器制造有限公司）、电热恒温培养箱（2XDP-2160，上海智联分析仪器制造有限公司）、一次性使用培养皿（90 mm，泰州市顺飞医疗器械有限公司）、光学显微镜、加热器、无极式煮药壶、分析天平、涂布器、牛津杯、游标卡尺、大烧杯、试管、锥形瓶、酒精灯、孔径23 μm滤网、载玻片、革兰氏染液、接种环和移液器等。

1.2 方 法

本试验首先采取调查研究的方法，通过调查蛋鸡养殖户、兽药经营者和临床一线兽医选择了5 种大家普遍认可的单味中草药和一味复方中草药制剂，然后进行实验室研究，利用培养基做药敏抗菌对比试验，选择出效果比较好中草药，最后进行验证试验，将选出的中草药应用在大肠杆菌的鸡群中，观察疗效。在此主要阐述实验室研究方法。

1）培养基的制备：用分析天平按着培养基说明书配比量，称取0.5 L 量的培养基所需的培养基粉，放入烧杯中，加纯化水，用玻璃棒搅拌至充分溶解。（普通营养琼脂培养加入琼脂）然后在加热器上加热，同时用玻璃棒搅拌，加热至有小气泡冒出时停止。测试pH 值，调节pH 值后，分装在锥形瓶内，加盖棉塞，放置自动压力高温灭菌锅内121 ℃高压灭菌15 min，灭菌冷却后，在超净工作台内分装到培养皿内，肉汤培养基分装到试管内，加盖棉塞，放入4 ℃冰箱冷藏备用[2]。

2）制备菌液：取正常笼养蛋母鸡，采用不出血方式处死，进行无菌解剖，打开肠道，用接种环在酒精灯火焰高温灭菌后，在鸡大肠上轻刮，然后再采用划线分离法在伊红美蓝培养基上接种，37 ℃恒温培养24 h，选取单个合适大肠杆菌菌落，用接种环刮取半个菌落（可多选取几个备用，但要标记清楚），在灭菌后的载玻片上，用革兰氏染色法进行染色，晾干成片后，显微镜下进行镜检，确定为纯大肠杆菌菌落后（如若不纯，则需要进行纯培养，直至完全为纯大肠杆菌菌落为止），在超净工作台无菌环境中，把显微镜镜检确认为纯大肠杆菌的剩下半个菌落，在自制营养肉汤中用灭菌接种环接种，放置37 ℃恒温培养箱内培养24 h。然后对鸡大肠杆菌，用平板菌落计数的方法进行计数，调整好鸡大肠杆菌菌液的最终浓度为1×108cfu/L 备用[3]。

3）单味中草药药液的制备与萃取：用传统水提法萃取有效的成分。办法为：各取50 g 放入大烧杯中，加入1 000～2 000 mL 的纯化水中浸泡2 h，浸泡的水不虑出，放入药壶中，大火煮开后文火煮0.5 h，用孔径约0.32 mm 的滤网过滤药汤，将药汤过滤在烧杯中，另加1 000 mL 的纯化水在药壶中，用同样方法将药渣再煮一遍，后用孔径约0.32 mm的滤网过滤，合并2 次过滤后的药汤，放入烧杯中，并加入沸石进行蒸发浓缩，药汤浓缩最终浓度为1 g/mL，即50 mL 药汤，然后分装放入离心管中，离心沉淀提纯后，测试药汤的pH 值，调整pH 值为7.2 ～7.3，将调整好pH 值的药汤，放在锥形瓶中，用纱布封口，在自动试压力蒸汽器内，121 ℃高压灭菌15 min，然后取出，将5 种单味中草药药汤各取10 mL，混匀后放入4 ℃冰箱冷藏保存备用。

4）抗生素药敏纸片制备：取灭菌后的烧杯，注入硫酸庆大霉素注射液，再放入无菌生理盐水稀释。将剪裁好灭菌的定性滤纸（直径6 mm）放入稀释过的硫酸庆大霉素注射液中，充分浸泡，然后无菌晾干，备用。

5）复方中草药制剂药液的制备：将复方中草药制剂放在烧杯中加入纯水，按一定比例稀释，使每一种复方制剂达到1 mL 药液相当于原生药1 g，测试药液的pH 值，调整pH 值为7.2 ～7.3，将调整好pH 值的板青败毒口服液，分装在锥形瓶中，用纱布封口，在自动试压力蒸汽器内，121 ℃高压灭菌15 min，再从混合后的5 种单味中草药混合液中取25 mL 与25 mL 复方中草药药液混匀，后放入4 ℃冰箱冷藏保存备用[4]。

6）抑菌圈的直径测量办法：用牛津杯法来分别测定，取浓度为1×106cfu/mL 鸡大肠杆菌液0.1 mL，在超净工作台无菌的环境下，将涂布器在酒精灯上灭菌，用涂布器蘸取鸡大肠杆菌菌液，轻轻均匀涂布在普通营养琼脂培养基平板上，并在一级超净工作台等待吸收，取出无菌的牛津杯，在无菌的环境中，放在普通培养基平板上，加满提纯后的中草药萃取药液，调好牛津杯工作状态，将牛津杯和涂布大肠杆菌的普通营养琼脂培养基平板，静置30 min后，置放在恒温培养箱37 ℃培养12 h，每种单味中草药纯化萃取药汤、复方板青败毒口服液及其混合液，都需要重复试验3 次，以减少实验误差，后用游标卡尺测量抑菌圈的直径，如同种中草药实验数据差值过大，则需再加做2 次，以保证实验数据准确。取中草药灭菌抑菌圈的直径的平均值。硫酸庆大霉素注射液药敏纸片放置在涂布大肠杆菌的普通营养琼脂培养基平板上，净置30 min 后，放置恒温培养箱中37 ℃培养0.5 h，然后用游标卡尺测量抑菌圈的直径，抑菌效果衡量的标准为：抑菌直径≥20 mm 表示为极度敏感级，15 mm≤抑菌直径＜20 mm表示为高度敏感级，10 mm≤抑菌直径＜15 mm 表示为中度敏感级，抑菌直径＜10 mm 表示为低度敏感级[5]。

2 结果与分析

由表1 培养基扩散法中草药抗菌药敏试验结果可知，通过培养基扩散法测得，板蓝根、忍冬花、蒲公英、黄连、黄柏、硫酸庆大霉素注射液、板青败毒口服液、5 种单味中草药混合以及5 种中草药与复方制剂混合液的抑菌直径分别为21 mm、15 mm、16 mm、20 mm、14 mm、9 mm、28 mm、26 mm 和30 mm。根据抑菌效果衡量的判定标准得出结论，板蓝根、黄连、板青败毒口服液、5 种单味中草药混合液和5 种中草药与板青败毒口服液混合后对大肠杆菌为极度敏感，忍冬花和蒲公英为高度敏感，黄柏为中度敏感。培养基扩散法得5 种单味中草药、复方中草药制剂和抗生素对大肠杆菌抑菌效果，由强到弱依次为5 种草药与板青败毒口服液混合液＞板青败毒口服液＞5 种单味中草药混合液＞板蓝根＞黄连＞蒲公英＞忍冬花＞黄柏＞硫酸庆大霉素注射液[6]。

表1 培养基扩散法中草药抗菌药敏试验结果

3 讨 论

1）通过试验对比5 种单味中草药和复方中草药的抑菌圈直径得知，5 种单味中草药抑菌效果最好的为板蓝根，其中板蓝根和黄连的抑菌效果都达到了极度敏感效果，具有一定的临床实用价值，蒲公英、黄柏和忍冬花都属于低敏感度效果，硫酸庆大霉素与中草药抑菌实验效果相比较，板蓝根、忍冬花、蒲公英、黄柏、黄连和板青败毒口服液的抑菌实验效果均好于硫酸庆大霉素注射液，也具有一定的临床实用价值[7]。

2）复方中草药制剂板青败毒口服液、板蓝根和黄连抗大肠杆菌药敏实验结果都为极度敏感，适用于大肠杆菌的抗菌使用。复方中草药抑菌效果好于试验中其他5 味单味中草药。并且通过实验发现，5种中草药混合使用抑菌效果好于单种中草药抑菌效果。并且有混合种类越多，抑菌效果越好的特点，5 种单味中草药混合液与板青败毒口服液的联合使用的抑菌实验效果最好，故在临床用中草药治疗大肠杆菌应该优先考虑板青败毒口服液和其他中草药联合使用[8]。

3）根据走访相关禽类养殖户及查阅资料可知，部分中草药如单味中草药板蓝根和黄连，复方中草药板青败毒口服液对细菌有一定的抑制作用，并且具有残留极小、毒性较低、耐药性发生率低等特殊优势，被禽业养殖户和基层兽医较为广泛地应用于治疗大肠杆菌疾病。