人工湿地植物根际微生物对4种污水重金属元素的净化能力

罗 倩，林凤莲，袁 锋，潘国营，高倩倩，李 键，吴承祯，陈 灿

(1.福建农林大学，福州 350002; 2.武夷学院生态与资源工程学院，福建 南平 354300)

【研究意义】世界范围内工农业和生活污水重金属污染严重，使得污水处理成为亟待解决的技术难题[1-2]，日益受到关注[3-4]。Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+降解因难、长期性、大规模和不可逆的特性[5]，为水体污染最为严重的重金属，严重威胁居民生命安全。植物和微生物是人工湿地系统重要组成成分，开展人工湿地植物根际微生物对重金属吸附能力研究是解决水体重金属污染问题的重要途径。【前人研究进展】目前，处理重金属污染有物理、化学和生物修复法[6-8]。其中，人工湿地法运行成本低、维护简便、负荷能力强、污水净化效率高，微生物降解重金属越来越受到青睐[9-12]，并被广泛应用[13]。前人十分重视微生物对重金属的抗性和解毒作用，构建了植物-微生物-基质的复合缓冲系统，将微生物活细胞作为廉价、高效吸附剂净化重金属污水[14-15]。例如：马佳林等[16]研究得到酵母菌和枯草芽孢杆菌对铀(VI)的最佳吸附率分别高达97.19%、98.03%；冯旭等[17]研究表明，人工湿地组合回流立式对重金属As、Cd、Pb、Cu和Zn的平均去除率在50%以上。类似研究大多针对单一金属离子或停留于重金属某一时刻去除效果，实际污水成分复杂，面对高浓度污水，菌株存在一定忍耐上限，超过一定阈值，极可能丧失吸附能力甚至死亡，吸附过程中菌株的吸附率也处于动态变化，但内在规律所知甚少，忽视污水中重金属的初始浓度和动态变化将对菌株吸附能力准确评估产生误差，也会对筛选最优菌株造成偏差，错失最优的湿地净化重金属方案并对菌剂的配制产生不利影响。【本研究切入点】本文以前期筛选10株优质菌株为研究对象，测量其在不同重金属初始浓度、不同反应时间去除重金属离子(Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+)的效果，以期挑选不同初始浓度下重金属降解能力突出的高效菌株，并进一步探讨真菌和细菌吸附污水重金属的内在机制。【拟解决的关键问题】为城市重金属污水处理系统中高效菌种的选择提供依据，为微生物菌剂研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 所用菌种采自武夷山市污水处理人工湿地植物再力花(Thaliadealbata)、香根草(Vetiveriazizanioides)、花叶芦荻(Arundodonaxvar.versicolor)根际土壤，筛选和鉴定所得5株高效细菌B2(Bacilluscereus)、B5(B.thuringiensis)、B19(B.megaterium)、B21(B.thuringiensis)、B35(B.cereus)和5株高效真菌F9(Westerdykelladispersa)、F16(Aspergillusnigerstrain)、F25(Penicilliumjanthinellumstrain)、F26(A.iizukae)、F30(Paecilomyceslilacinusstrain)。其中菌株B2、B5、B35、F9和F16筛选自花叶芦荻根际土壤，B19、B21和F26筛选自香根草根际土壤，F25和F30筛选自再力花根际土壤。

1.1.2 供试污水 参照武夷山市生活污水处理厂和工业污水处理厂进水水质，用KH2PO4、葡萄糖、蛋白胨、硫酸铵、铜、锌、铅、镉标准溶液、超纯水模拟配置不同浓度的模拟污水[19]，详见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 吸附前后5株细菌和真菌培养和测定参考文献[20]，重复3组，共测定396个样品[20]。

表1 不同浓度污水各项指标浓度

1.2.2 重金属浓度测定方法 取100 mL水样和5 mL硝酸于200 mL烧杯中，电热板加热消解至10 mL左右后滴入5 mL硝酸和2 mL高氯酸，消解至1 mL左右。冷却定容至100 mL后采用原子吸收分光光度计测定。吸附率公式[21]如下：

R=(C0-Ct)/C0×100%

(1)

式中，C0为溶液中重金属离子初始浓度(mg/L)；Ct为吸附时间为t时的浓度(mg/L)。

1.3 数据处理和统计分析

采用Microsoft Excel 2013软件和IBM SPSS Statistics 19.0软件进行数据分析整合，采用多项式模型对细菌和真菌拟合，基于单因素方差分析(One-Way ANOVA)和多因素方差分析(Multi-Factor ANOVA)，采用最小显著差异法(LSD法)进行显著性检验和多重比较，显著性水平为0.05，并采用指数和多项式方程对吸附过程拟合及Origin 2018绘图。

2 结果与分析

2.1 高效菌株对不同浓度污水Pb2+的吸附效果

整体上10株菌株对Pb2+均有不同程度的吸附作用，吸附时间越长，Pb2+含量越少。由图1可知，菌株B21和高浓度下B35污水Pb2+浓度变化呈反“J”字型趋势，菌株F26和F16呈倒“N”字型趋势，其余菌株均随时间变化呈下降趋势，不同时间各菌株浓度变化存在显著差异(P< 0.05)。不同菌株12 h节点Pb2+浓度微下降，趋势平稳。48 h后，高浓度污水菌株吸附Pb2+能力表现为B19>F25> B5>F30>F9>F16>B2>B35>F26>B21>CK，吸附率为27.30%～52.27%，其中菌株B19、F25和B5表现优异，吸附能力突出，吸附速率显著高于其他处理(P<0.05,图1-A)。

菌株吸附Pb2+效果与污水浓度显著相关(P< 0.01)，且较低浓度污水中菌株吸附效果显著优于高浓度污水。菌株B19、F25和F16中浓度污水吸附效果略优于低浓度污水。3种浓度处理48 h后，菌株吸附能力排名表现为B19>F25>B5>F9>F16>F30>B2>F26>B35>B21>CK，吸附率为32.17%～56.07%，3种浓度下菌株的时间越长，菌株吸附率越高，其中菌株B19、F25、B5表现优异(图1-B)。低浓度下B21、F16和F26的Pb2+浓度呈先下降后上升的趋势，说明3株菌株吸附率呈突击式变化趋势，时间因素对吸附率影响较大。低浓度污水菌株吸附能力排名：B19>F25>F30>B5>F9>F16>B2>B35>F26>B21>CK，吸附率为32.17%～56.07%，其中菌株B19、F25和F30表现优异(图1-C)。

A.高浓度污水；B.中浓度污水;C.低浓度污水A.High concentration sewage; B.Medium concentration sewage; C.Low concentration sewage图1 不同菌株处理下不同污水Pb2+浓度的动态变化Fig.1 The dynamic change of Pb2+ concentration in different sewages and strains

由表2可知，不同菌株与浓度、不同菌株与时间、浓度与时间及三者之间均存在显著的交互作用，不同时间、不同浓度均对菌株吸附率有显著影响，吸附率显著高于CK，时间越长，吸附率越高。

处理时间、污水浓度对菌株吸附率影响显著，不同菌株对Pb2+、Cd2+、Cu2+、Zn2+的吸附率均显著高于CK。在3个污水浓度中，菌株吸附效果在低浓度和48 h最优,中浓度污水条件下次之，真菌对不同浓度污水重金属离子吸附效果优于细菌。

2.2 高效菌株对不同浓度污水Cd2+的吸附效果

由图2可知，不同菌株在不同处理时间段吸附能力存在显著差异(P< 0.05)，吸附能力差异较大，污水中Cd2+浓度显著低于CK(P< 0.05)。菌株F26和F30处理下污水Cd2+浓度呈“N字型变化趋势”，高低浓度下菌株B2和B21处理下Cd2+浓度呈梯度下降后略微上升的趋势，中浓度处理下的B21趋势变化较小，其他菌株Cd2+浓度随时间推移呈下降趋势。

各菌株的吸附速度及在不同污水浓度吸附能力差异大。菌株F26和B19在高浓度污水和低浓度污水中Cd2+的吸附速度较快，显著高于其他处理(P< 0.05)，表现优异，其中低浓度污水中菌株F2624 h吸附率达37.57%。中浓度污水下菌株F30、F26、F25和B2吸附速度较快，24 h后吸附率分别为29.67%、25.26%、24.58%和24.24%。48 h后，高浓度污水中不同菌株吸附能力表现为B19>F9>F16>F30>B5>F25>B2>F26>B21>B35>CK，吸附率为29.63%～56.00%，其中菌株B19、F9、F16处理下污水中Cd2+浓度分别为4.400、4.540和4.560 mg/L，吸附率分别高达56.00%、54.60%、54.40%。中浓度污水中不同菌株吸附能力表现为F9>B19>F16>F30>F25>B5>B21>B2>F26>B35>CK，吸附率为31.03%～58.70%，其中菌株F9、B19、F16处理下污水中Cd2+浓度分别为2.065、2.090和2.217 mg/L，吸附率分别达58.70%、58.20%、55.66%。低浓度污水中不同菌株吸附能力表现为：F9>F16>B19>F30>F25>B5> B21>B2>F26>B35>CK，吸附率为31.53%～59.23%，其中菌株B19、F25、B5处理下污水Cd2+浓度分别为0.408、0.414和0.419 mg/L，吸附率分别达59.23%、58.63%、58.07%。

2.3 高效菌株对不同浓度污水Cu2+的吸附效果

由图3可知，不同菌株对不同浓度Cu2+的吸附能力差异较大，各浓度污水中Cu2+浓度显著低于

表2 不同浓度、菌株和时间的相关性

A.高浓度污水；B.中浓度污水;C.低浓度污水A.High concentration sewage; B.Medium concentration sewage; C.Low concentration sewage图2 不同菌株处理下不同污水Cd2+浓度的动态变化Fig.2 The dynamic change of Cd2+concentration under different sewages and strains treatments

CK(P<0.05)。菌株F26和F16处理下Cu2+浓度呈下降—微上升—下降的趋势，菌株B21和B35处理下Cu2+浓度呈下降—下降—微上升的趋势，其他处理Cu2+浓度均呈下降趋势。高低浓度中菌株F16、F26和F30对Cu2+的吸附较快，其中高中低浓度下菌株F16处理24 h后吸附率最高，分别达36.67%、25.90%、29.23%。

不同菌株在不同处理时间下吸附Cu2+能力各异。高浓度污水中菌株处理48 h后，吸附能力表现为F25>B19>F9>F30>F16>B5>B2>F26>B35>B21>CK，吸附率为29.03%～55.73%，其中菌株F25、B19、F9处理下Cu2+浓度为4.427、4.716和4.990 mg/L，吸附率为55.73%、52.83%和50.10%。中浓度污水菌株处理48 h后，吸附能力表现为F25>B19>F30>F9>F16>B5>B2>F26>B35>B21>CK，吸附率为29.83%～57.73%，其中菌株F25、B19、F9处理下污水中Cu2+浓度分别为2.113、2.288和2.491 mg/L，吸附率为57.73、54.23%和50.17%。低浓度污水菌株处理处理48 h后，吸附能力表现为F25>B19>F9>F30>F16>B5>B2>F26>B21>B35> CK，吸附率为35.10%～59.00%，其中菌株F25、B19、F9处理下污水中Cu2+浓度分别为0.410、0.429和0.445 mg/L，吸附率为59.00%、57.06%和55.53%。

2.4 高效菌株对不同浓度污水Zn2+的吸附效果

由图4可知，不同菌株对Zn2+吸附能力强且差异较大 (P<0.05)。总体来说，菌株B2处理下Zn2+浓度呈下降—微上升—下降的趋势，菌株F26和F30处理下Zn2+浓度呈下降—下降—微上升的趋势，高浓度污水中菌株B21和中浓度污水中菌株F9呈同样趋势，其他处理污水Zn2+浓度均呈下降趋势。

不同浓度污水中各菌株吸附Zn2+浓度存在显著差异(P< 0.05)。48 h后，高浓度污水中菌株吸附能力表现为F16>F25>B19>F9>B5>B35>F30>B21>B2>F26>CK，吸附率为29.67%～56.73%，其中菌株F16、F25、B19处理下污水中Zn2+浓度分别为4.327、4.973和5.023 mg/L，吸附率分别为56.73%、50.27%和49.77%。中浓度污水中吸附能力表现为F16>F25>B19>F9>B5>F30> B35>B2>F26>B21>CK，吸附率为31.27%～58.10%，其中菌株F16、F25、B19处理下污水中Zn2+浓度分别为2.095、2.348和2.500 mg/L，吸附率分别为58.10%、53.03%和50.00%，低浓度污水中菌株吸附能力表现为F16> F25>F9>B19>B5>F30>B35>B21>B2>F26>CK，吸附率为36.00%～60.27%，其中菌株F16、F25、F9处理下污水中Zn2+浓度分别为4.327、4.973和5.023 mg/L，吸附率分别为60.27%、54.00%和49.77%。

A.高浓度污水；B.中浓度污水;C.低浓度污水.A.High concentration sewage; B.Medium concentration sewage; C.Low concentration sewage图3 不同菌株处理下不同污水Cu2+浓度的动态变化Fig.3 The dynamic change of Cu2+ concentration under different sewages and strains

2.5 不同培养时间菌株对污水的吸附效果

由图5可知，不同浓度污水中，菌株B19、F9、F25和F16表现优异，吸附速率高，明显超过其他菌株。在高浓度污水中，不同菌株对重金属离子的平均吸附率为42.51%，6个菌株吸附率在平均值之上，B2、B21、B35和F26未达吸附率平均值，吸附效率表现较差。菌株B19、 F16和F25吸附率高，平均值分别为4.7283、4.9867和5.0283 mg/L，吸附率达52.80%、50.22%和49.80%，吸附效果较好。其中，菌株F16对重金属离子Cd2+和Zn2+吸附效果明显优于Pb2+和Cu2+，前者的平均吸附率为55.63%，后者的平均吸附率为44.8%，吸附率相差10.83%。

中浓度污水中，菌株B19、F25和F16吸附速率较高，平均值分别达2.2687、2.3984 和2.3540 mg/L，吸附率分别为54.65%、52.94%及52.05%。

低浓度污水中，不同菌株对重金属离子的平均吸附率为46.24%，较高浓度污水吸附率高3.73%，中浓度污水2.13%，6个菌株吸附率在平均值之上，B2、B21、B35和F26未达吸附率平均线，吸附效率表现较差。菌株B19、F16、F25和F9表现较好，吸附率分别达55.12%、53.96%、53.51%、53.29%。

由图6可知，随菌株培养时间延长，吸附率呈明显上升趋势。12～24 h时，真菌与细菌平均吸附率均表现为急剧吸附阶段，真菌平均吸附率达24.66%，细菌达22.38%，几乎达到平衡时吸附量的50%，其中细菌中Zn2+24 h吸附率达24.43%，高出平均吸附率2.05%。24～36 h时，真菌增长趋势趋缓，与之不同的是，Zn2+离子吸附率增速加快，平均吸附率为40.54%，高出Cd2+吸附率10.08%，细菌平均吸附率仍呈现快速增长阶段，36 h对Pb2+

A.高浓度污水；B.中浓度污水;C.低浓度污水A.High concentration sewage; B.Medium concentration sewage; C.Low concentration sewage图4 不同菌株处理下不同污水Zn2+浓度的动态变化Fig.4 The dynamic change of Zn2+ concentration under different sewages and strains

离子吸附率为31.15%。36～48 h时，真菌中Pb2+、Cd2+和Cu2+离子重新进入快速吸附阶段，吸附平均增长率为15.66%，Zn2+离子吸附增长放缓，增长率仅5.10%，48 h平均吸附率排名为Cu2+> Cd2+> Zn2+> Pb2+。细菌中4种金属离子吸附率增速趋缓，平均增长率仅7.06%，48 h平均吸附率排名为Pb2+> Zn2+> Cd2+> Cu2+。真菌平均吸附率为46.38%，细菌平均吸附率为40.11%，真菌优于细菌6.27%。

2.6 菌株吸附效果随时间的模型拟合

为更好揭示菌株吸附过程，基于细菌与真菌平均吸附率变化趋势线，实验拟合多项式模型如表3所示。

表3 细菌与真菌拟合模型

图5 不同菌株处理下不同浓度污水的变化Fig.5 The change of different concentration sewages under different sewages and strains

图6 不同菌株培养时间下真菌与细菌的平均吸附率Fig.6 The average adsorption rate of fungi and bacteria under different strain culture time

3 讨 论

不同菌株对不同重金属离子亲和力不同，真菌优于细菌。有研究表明，藻体对Zn2+、Pb2+的吸附性均高于Cu2+和Cd2+，当最高胁迫浓度 (120 mg/L) 培养至6 d时，杆裂丝藻对Cu2+和Cd2+吸附率差异较大，去除率分别为99.14%和87.73%[22]。与之相比，本研究中，高浓度污水中菌株培养2 d后，B19对Cu2+和Cd2+吸附率较低(52.87%、56.12%)。菌株F16对重金属离子Cd2+和Zn2+吸附效果明显优于Pb2+和Cu2+，菌株B2对Zn2+的吸附速率显著大于Pb2+、Cd2+和Cu2+的吸附速率，这可能与不同菌株细胞活性不同有关[22]。Neethu等[23]研究表明130株肠杆菌和假单胞菌对不同重金属耐受性不同，原因主要在于外排泵和荚膜多糖的产生，但更多与细胞质粒有关。Martins等[24]研究指出，P.citrinum,P.brasilianum,P.funiculosum和P.janczewskii4种物种比其他离子能更有效地去除铅，真菌P.brasilianum对铅具有更好的亲和力，与本文结果一致。本试验中，真菌对污水中重金属的吸附率大于细菌(6.48%)，前者平均吸附率为47.53%，后者平均吸附率为41.05%，这可能由于本试验中筛选出的真菌菌丝较多，摇瓶培养过程中与金属离子接触面积较大，提高了真菌的吸附率。

微生物对重金属的吸附效果与污水中重金属浓度密切相关，中低浓度优于高浓度。本试验中，高浓度污水中菌株B21对Pb2+吸附度呈现上升—上升—下降的变化趋势，从9.35 mg/L降至6.28 mg/L后又升至7.24 mg/L，说明时间越长，吸附能力越低，吸附能力与初始浓度负相关，这可能与菌株对重金属离子浓度有一个耐受范围有关，超过其耐受范围可能会抑制菌株，降低菌株活性，去除率则随时间变化呈下降趋势[25]。赵琪琪等[26]研究表明茎点霉属 (Phomasp.)最大耐受浓度为 6000 mg/L，浓度越高，生物量减少越快，印证了中低浓度下微生物对重金属离子吸附率较高，与本文研究一致。本研究发现，重金属起始浓度对重金属吸附有一定影响，菌株在中低浓度污水中平均离子吸附率为45.17%，远高于高浓度污水中42.51%，中低浓度污水吸附率优于高浓度，这可能由于重金属浓度过高导致微生物表面结合位点不足，加剧离子间互相竞争，影响吸附效率[27]。毛凯等[28]研究表明溶液初始浓度为0～2 mmol/L时Zn2+的吸附量增加明显,当浓度超过2 mmol/L时吸附量开始趋于饱和，低浓度中吸附效率高，与本研究结果一致。不同菌株对不同重金属离子吸附效果差异较大还受微生物遗传特性和金属离子属性等因素有关[29]。

菌株培养时间对金属离子吸附效果影响较大，两者呈显著指数正相关关系(P<0.01)。本研究中，菌株F16、F26和B2吸附率呈快速下降后趋缓的趋势，Cd2+离子变化不明显，这可能由于金属离子在胞外和胞壁共同作用下，大量有机物分泌促使离子沉淀[30]，消耗过多能量，离子进入细胞内部时，吸附速率减小。Li等[31]研究指出实验开始仅1 h菌株C.lacerata对铜的吸附率高达86%，随后缓慢降低，原因可能在于其pH值降低导致H+离子与Cu2+和CuOH+离子竞争，影响生物吸附位点。本研究发现，菌株F26和B21呈下降—下降—微上升的趋势，高浓度污水中菌株B2呈同样趋势，这可能由于重金属离子通过膜表面的转运蛋白进入细胞内部[32]后，细胞化合有机物被分解，使部分重金属离子回到溶液，致使浓度回升，或因细胞内部泵加大工作力度，将内部离子排出，具体机制待进一步探索。本试验中，B5、B19、F25等菌株吸附率随培养时间延长呈阶梯式下降趋势，这可能因为胞外富集、沉淀，胞壁络合、胞内富集同时运作[33]，细胞分泌有机物使离子沉淀，胞壁进一步吸附，胞内缓慢沉降，使得重金属离子吸附率呈线性过程。

微生物吸收阶段的参与度以及分泌物数量可能是影响重金属吸收效果主要内在机制。微生物吸附重金属的过程主要分为两个阶段：第一个阶段是微生物可通过自身生长的过程中产生的蛋白质、多肽及羧酸等物质与重金属络合快速吸附重金属离子；第二阶段是重金属离子经微生物活体细胞的主动吸附，与酶结合实现细胞内富集，过程较为缓慢[34]。本研究中， B35、F16和F25等菌株吸附率呈明显上升趋势，其中菌株F25在高浓度污水中Pb2+浓度从9.294 mg/L 经48 h后降至4.854 mg/L，降低了4.44 mg/L，吸附速率较快，说明菌株吸附率呈突击式变化趋势，分泌物数量增加，这可能与微生物参与度不断提高有密切关系，处理时间越长，微生物生物量和分泌物增加，菌株菌体及产生的酶与污水中重金属离子的接触率增加，微生物吸收阶段参与度提高，明显提高了污水离子吸附率[35]。

本试验利用单菌悬液净化污水，并未进行不同菌株间的配比试验及所用污水来自实验室自配污水，与自然条件下的污水差异较大，后续试验可将室内试验推广到室外试验，更好模拟自然条件，以探究自然条件下菌株对不同污染物的净化效果，同时本次试验未涉及pH值测定和生物吸附剂等因素对菌株吸附率的影响，吸附机理尚未完全验证，今后研究将细化明确胞外沉淀、胞壁吸附及胞内排放相关机制。

4 结 论

(1)从4株人工湿地植物根际土壤中所得5株真菌和5株细菌菌株，共测定396个样品，其中B19、F16、F25、F9是中高低浓度重金属净化的优势菌株。

(2)不同处理时间、污水金属初始浓度和菌株种类均对吸附污水中重金属离子的效果有显著影响。

(3)菌株对重金属的吸附效果在低浓度和48 h最优且真菌优于细菌，细菌平均吸附率符合指数函数模型，真菌平均吸附率符合幂函数模型。