DNA甲基化作为宫颈病变潜在生物学标志物的研究进展

王淑玲 赵卫红

在女性恶性肿瘤中，宫颈癌的发生率和病死率位居第四，严重危害女性健康。2018年，全球宫颈癌新发病例约57万例，死亡病例约31.1万例，且大部分发生在发展中国家[1]。可以确定的是，人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)持续感染是宫颈癌前病变和宫颈癌的首要原因，但其具体发病机制尚不清楚。临床上现行的宫颈病变筛查手段存在局限性，仍需有效的分流策略避免无病女性的不必要转诊和HR-HPV阳性女性的过度治疗。因此，有必要阐明导致宫颈病变恶性进展的机制并开发新的筛查和治疗方案。

越来越多的研究表明，宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和宫颈癌的发生、发展离不开表观遗传学的参与。表观遗传修饰(epigenetic modification)是指在不干扰有丝分裂或减数分裂的情况下对表观基因组基因表达的调节，如DNA甲基化(DNA methylation)、羟甲基化、组蛋白修饰、去甲基化、非编码RNA的调节等[2]。目前DNA甲基化是研究得最透彻的表观遗传修饰，也是最重要的化学修饰形式。在HPV感染期间，宿主基因和HPV的异常甲基化促使相应基因表达异常，进而影响宫颈癌细胞增殖、凋亡和宿主免疫反应，推动肿瘤病情进展[3]。HPV感染与宿主DNA甲基化可互相调控，DNA甲基化异常可影响HPV感染，HPV感染也与DNA甲基化异常有关。异常的DNA甲基化可能有助于区分非渐进性HPV感染以及癌变等级，在宫颈病变筛查中表现出极大的应用价值。

一、宿主DNA甲基化

DNA甲基化通常发生在肿瘤抑制因子、转录因子和细胞周期调节因子基因的CpG二核苷酸中的胞嘧啶上，通过启动子沉默抑制基因表达导致整体低甲基化和基因特异性高甲基化，在包括宫颈癌在内的致癌机制中起关键作用[4]。目前在宫颈组织中已检测出超过100种甲基化标志物, 近20种在文献中被报道, 其中约有10种基因的甲基化水平在宫颈高级别病变 (high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL) 和宫颈癌中升高[5]。同时由于DNA甲基化有较高的特异性，故现阶段也正被研究作为宫颈病变筛查的潜在标志物。

1.CADM1甲基化：细胞黏附分子1(cell adhesion molecule 1，CADM1)，最初也称为肺癌抑制基因1(lung cancer tumor inhibitor 1，TSLC1)，是编码免疫球蛋白家族的一种跨膜蛋白，参与上皮细胞黏附[6]。Yanatatsaneejit等[7]通过体外细胞实验发现，CADM1在转染HPV16 E7的人宫颈癌细胞系C33a细胞中因甲基化而失活，并进一步证明了E7癌蛋白与内源性DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1，DNMT1)结合形成复合体诱导CADM1启动子甲基化，引起肿瘤抑制基因表达沉默，导致下游基因表达水平发生变化，诱发肿瘤。Steenbergen等[8]早在2004年提出CADM1基因超甲基化与宫颈病变的进展有关。CADM1的甲基化水平可随着宫颈病变的严重程度而增加，也就是说，CADM1有区分各级宫颈病变的潜力[9]。而且Dankai等[10]在对3种肿瘤抑制基因(CADM1、FAM19A4和MAL)的甲基化水平进行评估时，发现在区分HSIL与低度鳞状上皮内病变(≤LSIL)时CADM1基因甲基化的诊断效能最高，其受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)下的面积(area under curve,AUC)为0.684。CADM1不仅是宫颈筛查的高效生物学标志物，而且血浆CADM1甲基化和D-二聚体(D-dimer)联合检测有望成为宫颈癌的转移标志物。Rong等[11]在预测宫颈癌转移时，血浆CADM1甲基化和D-dimer联合的AUC为0.903(95% CI：0.845～0.961，P<0.001)，敏感度为80.4%，特异性为90.5%。因此，CADM1甲基化可作为宫颈病变筛查、诊断及宫颈癌转移潜在生物学标志物。

2.FAM19A4/miR124-2甲基化：具有序列相似性的19家族[趋化因子(c-cmotif)-样]成员A4(family with sequence similarity 19 member A4，FAM19A4)，又名TAFA4,是编码小分泌蛋白的5个高度同源基因TAFA家族成员。FAM19A4在正常组织中表达水平较低，在巨噬细胞和单核细胞中呈高水平表达，对巨噬细胞的吞噬和迁移起促进作用，并调控炎症感染和应激反应。伍恒英等[12]推测，FAM19A4基因甲基化诊断宫颈癌的的检测方法能够不受HPV的干扰, 尤其是在HR-HPV阴性宫颈癌的诊断中优势更加突出。同样，Vink等[13]的一项全球性研究发现，FAM19A4的甲基化水平与宫颈病理组织类型、宫颈癌临床分期、HPV状态及HPV基因型均无关。该团队在荷兰筛查队列中将FAM19A4/miR124-2 基因甲基化与细胞学相结合，检测CIN3+的敏感度达84.6%(95% CI：78.3%～90.8%),特异性为69.6%(95% CI：66.5%～72.7%)，展现出良好的分诊效能[14]。Bu等[15]研究发现，FAM19A4与细胞学分级呈正相关，甲基化率由低到高依次为正常宫颈组织、LSIL、HSIL、宫颈癌(10.61%、35.48%、56.14%和93.44%)。De Strooper等[16]对FAM19A4/miR124-2甲基化测试细胞学阴性(

3.PAX1甲基化：配对盒家族基因1(paired box1，PAX1)是PAX家族的成员，位于人染色体20p11.2，在胚胎发育和调控细胞分裂和增殖方面发挥重要作用[17]。它参与肿瘤的发生与发展，在宫颈癌的筛查、诊断、治疗及预后中发挥着重要的作用。PAX1基因主要负责维持宫颈上皮内激酶和磷酸酶之间的开关稳态。PAX1基因通过激活蛋白酪氨酸磷酸酶受体R(protein tyrosine phosphatase, receptor type R，PTPRR)抑制ERK1/2磷化，抑制致癌激酶的活性。同样，在SET1B和WDR5作用下PAX1基因诱导组蛋白H3第4号赖氨酸(histone H3 lysine 4，H3K4)甲基化，激活了一系列的磷酸酶。然而，HPV感染可能会使PAX1发生甲基化，引起PAX1蛋白表达缺失，抑制致癌激酶级联，破坏这种平衡[18]。Lai等[19]报道了PAX1异常甲基化与宫颈癌有关，PAX1发生高甲基化抑制其表达，经去甲基化处理后基因重新表达，发挥其抑癌作用。李碧军等[20]研究发现，PAX1基因的甲基化具有较高的敏感度和特异性,在细胞学异常(ASC-US、LSIL、ASC-H)女性中通过PAX1甲基化检测分流可提高对HSIL+的检出率，而且使用PAX1甲基化代替HPV检测对细胞学进行分流时,阴道镜转诊率可降至34.91%。当宫颈恶性与非恶性病变的临界值(△Cp值)为13.28时，PAX1甲基化检测的敏感度、特异性和AUC分别可达92.30%、78.60%和0.902，其阳性预测值为80.00%，阴性预测值为91.67%[21]。

二、HPV-DNA甲基化

除宿主DNA甲基化与宫颈病变有关外，HPV-DNA甲基化也与宫颈病变进展有关，HPV-DNA甲基化正被用作宫颈病变筛查的重要标志物。HPV基因组有3个功能域，即早期转录区(E1～E7)、晚期转录区(L1和L2)、以及一个控制区(long control region，LCR)，这些区域中的甲基化与CIN和宫颈癌的发生有着密切的关系。其中，研究最多的有E6、E7、L1、L2和LCR区CpG位点甲基化。研究表明，L1和L2区的甲基化程度随着疾病的严重程度而增加[22]。关于LCR区的甲基化研究结果尚不一致。Bowden等[22]对44项HPV DNA甲基化研究进行系统回顾和Meta分析，发现HPV LCR区的甲基化与疾病严重程度无关，15项研究报告在HSIL中LCR区甲基化程度较高，另6项研究的结果却与之相反。

在12种致癌HPV类型中，HPV16、HPV18与HPV45甲基化水平与CIN3和宫颈原位腺癌(cervical adenocarcinoma in-situ, AIS)相关性最强[23]。有研究表明，HPV16L1、L2、E2和E4区的高甲基化与CIN3和HPV持续感染的风险增加有关，E6基因的高甲基化提示发生高级别宫颈病变的风险降低[24,25]。在一项基于10年随访宫颈癌筛查队列中，评估了HPV16单独甲基化或联合E6癌蛋白对CIN3+的预测能力。Dong等[26]研究发现，在HPV16阳性女性中，甲基化组结合E6癌蛋白表现出明显的优势，AUC值为0.72～0.82，明显优于细胞学。

三、HPV与宿主DNA甲基化相互作用

虽说HPV感染与DNA甲基化间的关系尚未研究透彻，但可以确定的是，二者间相互作用共同促进宫颈癌的恶性病变。Yang等[27]研究发现，HPV感染与宫颈癌中DNA甲基化的调控相关。Huang等[28]探讨基因启动子甲基化与HR-HPV感染的相互作用，发现在宫颈癌前病变中HR-HPV感染与基因启动子环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase, cGAS)和线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein, MAVS)的甲基化水平之间有协同作用。高危型HPV16和HPV18感染与APC(P=0.008 和P=0.007)、SFRP1(P=0.003和P=0.0067)和PTTEN(P=0.049和P=0.008)启动子甲基化呈显著正相关[29]。Nedjai等[30]提出红细胞膜蛋白配体4.1样3(EPB41L3)甲基化可能发生在HR-HPV感染之前，并与病毒基因组扩增和遗传不稳定有关，使宫颈病变进展加快。

HPV基因组不仅自身会发生甲基化，HPV蛋白还可诱导宿主基因甲基化，影响相关基因的表达。在宫颈病变恶性转化过程中，HPV感染会引起宿主细胞的表观遗传重新编码，随后导致相应的HPV基因组表型变异[27]。特别是HPVE6 E7蛋白基因在感染HR-HPV到发展为宫颈癌中有着至关重要的作用。它们可诱导DNMT过表达，该酶可催化蛋白质编码基因和miRNA的异常甲基化[31]。HPV16 E6通过直接结合宫颈癌细胞中载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽3B(apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic subunit 3B，APOBEC3B)的启动子来上调APOBEC3B, 这与细胞周期蛋白D1(cyclinD1，CCND1)低甲基化和宫颈癌细胞增殖有关[32]。同样，HPV16 E7蛋白可以操控宿主细胞内的活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平引起乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A，LDHA)入核，入核后的LDHA获得一种非典型酶活性，产生α-羟基丁酸，并触发DOT1L介导的组蛋白H3赖氨酸79(histone H3 lysine 79，H3K79)高甲基化，导致抗氧化反应和Wnt信号通路的激活，Wnt通路异常活化，促进肿瘤细胞的增殖和转移[33]。此外，E7癌蛋白还可诱导组蛋白去甲基化酶(lysine-specific demethylase 5A, KDM5A)上调，而KDM5A与miR-424-5p的启动子结合，并通过去除H3K4的三甲基和二甲基来抑制miR-424-5p表达，进而影响宫颈癌细胞的增殖和迁移[34]。Na等[35]研究表明，HPV E7蛋白会引起C1QBP、BCAP31、CDKN2A和PTMS 4个基因启动子的异常甲基化，从而促进宫颈癌的发生和发展，但其具体的机制还有待研究。从这些研究可以看出，与HPV16 E6比较，E7癌蛋白在肿瘤的进展中似乎发挥更强大的作用。

四、展 望

鉴于DNA甲基化在宫颈病变中的关键作用，已有研究提出DNA甲基化有望成为宫颈癌筛查的生物学标志物，有助于探索病毒基因组与宿主基因组的整合，更深入了解宫颈癌的发病机制、更准确地筛查癌前病变，减少不必要的阴道镜转诊。而且联合甲基化检测可以获得更高的敏感度和特异性，展现出广阔的研究前景。但是目前的研究尚不充分，如各研究尚没有统一的标准导致不少研究结果不一致，关于甲基化的前瞻性研究较少等。因此，仍需深入探寻甲基化在宫颈癌发生、发展中作用，寻找最佳的生物学标志物，为宫颈癌的筛查和治疗提供新靶点。