心脏发育和疾病的表观遗传调控机制

袁婺洲,张亚楠

(湖南师范大学生命科学学院心脏发育研究中心,中国湖南 长沙 410081)

心脏发育是通过一系列基因调控和表观遗传修饰来严格协调、定时和校准的。传统的关于心脏发育及心脏疾病的基因调控研究主要集中于细胞内的信号通路及其下游的转录因子[1]。近年来,表观遗传学(epigenetics)的发展为研究者开启了一种全新的视角来看待心脏发育过程与病理性重构。表观遗传调控能在不改变DNA序列的情况下调节基因表达,其机制可以作用于基因组、非编码RNA以及核小体和染色质水平。本综述总结了DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑复合物和microRNAs在心脏发育中的调控作用(表1),以及近年来在动脉粥样硬化、心力衰竭、心肌缺血、心肌纤维化等主要心脏疾病中的表观遗传调控研究进展,并概述了生物活性食品化合物在心脏保护中的作用。

表1 与心脏发育相关的表观遗传修饰Table 1 Epigenetic modifications related to heart development

1 DNA甲基化与心脏发育

DNA甲基化是唯一已知的直接影响DNA分子的表观遗传调控机制。它与基因印记、X染色体失活、组织特异性基因表达的调控、细胞发育、基因组稳定性和剪接事件的调节有关[2]。DNA甲基化通常发生在哺乳动物中位于CG二核苷酸的胞嘧啶核苷酸的第5个碳上,该位点被称为CpG位点。这些CpG位点分布在整个基因组的基因区和基因间区[3]。启动子甲基化通常是抑制性的,其甲基化程度与启动子的CpG密度成反比。根据CpG密度可以将启动子分为两类:高CpG密度启动子(high CpG density,HCG)和低CpG密度启动子(low CpG density,LCG)[4]。在人类基因组启动子中,HCG启动子约占72%。这些启动子包含CpG岛,基本上没有甲基化,导致HCG启动子整体低甲基化。它们主要是管家基因的启动子。LCG启动子不包含CpG岛,与组织特异性基因调控有关[5]。在哺乳动物的发育过程中,DNA甲基化重编程包括甲基化标记的删除、重新引入和维持,它们被认为与主要细胞的谱系特化和分化过程相关[6]。

对心脏缺陷的胎儿心脏组织与正常胎儿心脏组织进行全基因组CpG位点特异性DNA甲基化分析,结果显示:甲基化差异区域邻近基因的表达在心脏缺陷的胎儿中表现出整体的低甲基化。这些基因的功能富集分析表明,低甲基化基因参与了胚胎心管的形态发生和免疫相关的调节功能,胎儿心脏缺陷可能与启动子邻近区域单个CpG位点甲基化改变有关,从而导致心脏发育相关基因的差异表达[7]。

DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)是负责维持或引入DNA甲基化标记的酶家族。DNMT家族包括3个主要成员:DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。其中,DNMT1与DNA甲基结合蛋白一起,在复制过程中维持DNA甲基化;DNMT3A和DNMT3B负责DNA的从头甲基化。

有研究发现,孕期饮酒可以导致胎儿酒精综合征,其中较为严重的畸形便是心脏发育畸形[8～9]。这种心脏发育畸形可能与DNA甲基化修饰失衡有关。因为与对照组相比,在酒精暴露的子代小鼠心脏组织中,DNMT的活性明显降低,肌细胞增强因子2A(myocyte enhancer factor 2A,MEF2A)的启动子区甲基化水平也显著降低;而受MEF2A调控的心脏发育相关基因,如心房利钠肽基因(atrial natriuretic peptide,ANP)、β-肌球蛋白重链基因(β-myosin heavy chain,β-MHC)、心肌肌钙蛋白T基因(cardiac troponin T,cTnT),在酒精处理组中的表达水平显著升高,说明在酒精导致心脏发育畸形的过程中,DNMT介导的DNA甲基化修饰失衡可能是子代小鼠心脏发育相关基因表达异常的重要调控因素[10]。T-box转录因子(T-box transcription factor,TBX)也广泛参与心脏发育的调控,包括TBX1、TBX2、TBX3、TBX5、TBX18 及 TBX20。它们在心脏发育的不同时空表达,在心脏谱系决定、心室特化、房室分割、心外膜发育和传导系统分化中起着重要作用[11]。有研究发现,TBX20基因启动子区(-400～-48 bp)甲基化水平降低造成的TBX20表达增高,可能抑制了TBX2的表达,进而导致TBX2的mRNA及蛋白质表达降低;而TBX20和TBX2基因的表达异常可能造成心脏房室管及流出道发育异常,这可能是导致法洛氏四联症(tetralogy of Fallot,TOF)发生的机制之一[12]。

2 组蛋白修饰与心脏发育

常见的组蛋白修饰包括乙酰化、甲基化、磷酸化、类泛素化、泛素化、生物素化和ADP-核糖基化等[13～14]。组蛋白修饰可以改变蛋白质的静电荷,从而改变其与DNA的相互作用,招募能够重塑染色质的受体蛋白,进而改变核小体的结构。

组蛋白乙酰化常发生在赖氨酸残基上,由组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferases,HATs)家族催化[15]。常见的HATs包括GCN5(general control nonrepressed 5)相关乙酰转移酶(GCN5-related acetyltransferase,GNAT)、延长复合蛋白3(elongator complex protein 3,ELP3)、核受体辅因子(nuclear receptor cofactor,NRCF)、E1A结合蛋白p300(E1A binding protein p300,p300)和CREB结合蛋白(CREB-binding protein,CBP)[16]。组蛋白去乙酰化是通过组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HD-ACs)来完成的,HDACs可根据序列相似性、表达、位置和酶活性分为HDACs 1～10等10种。组蛋白甲基化由组蛋白甲基转移酶(histone lysine methyltransferases,HMTs)催化,并由组蛋白去甲基酶逆转。组蛋白去甲基酶包括Jumonji家族成员和赖氨酸特异性去甲基酶1(lysine-specific demethylase 1,LSD-1)[17]。

组蛋白修饰对心脏的正常或异常发育具有重要影响。组蛋白乙酰转移酶p300敲除小鼠表现出明显的心血管缺陷和胚胎致死率。p300可能与心脏转录因子的两级调控有关。在转录后水平,p300直接与GATA结合蛋白-4(GATA-binding protein-4,GATA4)、Nkx2.5(NK2 homeobox 5)和 MEF2C相互作用并乙酰化,以调节它们的DNA结合和调节活性[18～19]。在转录水平,p300则直接与这些心脏转录因子的启动子结合,激活它们的转录。组蛋白去乙酰化酶HDAC1和HDAC2也调控心脏发育标志基因的表达和心肌细胞的分化。HDAC1敲除小鼠在胚胎发育的第10.5天致死[20]。而敲除HDAC2的小鼠则在出生后24 h内死亡。HDAC2敲除小鼠出现心肌层增厚,说明HDAC2抑制心肌的增长[21]。在缺失HDAC2和Hopx(homeodomain-only protein homeobox)的小鼠胚胎中,GATA4的乙酰化程度增加,且GATA4的靶基因表达上调,心肌细胞增长速度加快,新生小鼠的死亡率升高。此外,同时敲除HDAC5和HDAC9会使小鼠胚胎出现室间隔缺损、心肌变薄的畸形,最终在发育的第15.5天死亡[22]。

除了组蛋白乙酰化调控外,组蛋白甲基化状态也影响心脏的发育。肌肉特异性组蛋白甲基转移酶(muscle-specific histone methyltransferase,SMYD1)敲除小鼠表现出右室发育不全和胚胎致死[23]。组蛋白去甲基酶Jumonji家族成员的缺失会导致室间隔缺损和流出道缺损[24]。此外,其他赖氨酸去甲基酶如LSD-1也被证明会导致室间隔缺损[25]。在心脏发育过程中,H3K4me3和H3K27me3在基因调控区域的修饰状态是心脏发育相关基因激活和沉默的双向开关,且相互影响,H3K27me3富集程度的升高和H3K4me3富集程度的下降可维持非特异基因的沉默状态,反之则促进心脏发育相关基因的表达,从而调控心脏的发育。H3-K36me2/me3和H3K27me3存在相互拮抗作用,当一组蛋白质上H3K36me2/me3富集程度上升时,同一组蛋白质上H3K27me3的富集程度则会下降[26]。H3K36me3和H3K27me3的动态修饰是调控心脏正常发育的重要组蛋白甲基化修饰。

3 染色质重塑复合物与心脏发育

细胞分化和发育过程中的基因表达模式受高度动态的染色质结构影响,染色质重塑因子可以改变核小体的位置,调控基因表达,从而在心脏特化和发育过程中发挥重要的作用。ATP依赖性染色质重塑复合物通过改变染色质结构来调节转录活性,导致细胞内基因的激活和抑制[27]。这些染色质重塑复合物由不同的蛋白质组成,每个复合物都包含一种具有催化作用的ATP酶,可驱动核小体的置换或压缩。根据ATP酶中是否存在额外的功能结构域,这些染色质重塑复合物可分为四类:SWI/SNF(mating type switching/sucrose nonfermenting)、ISWI(imitation switch)、CHD(chromodomain helicase DNA-binding)和INO80(inositol autotroph 80)[28]。

SWI/SNF染色质重塑复合物一般由特异的ATP酶亚基Brg1(brahma related gene 1)或Brm(brahma)以及 BAF(Brg1/Brm-associated factor)等亚基组成[29～30]。研究表明,在小鼠胚胎早期发育过程中,与头部和躯干组织相比,4个特定的BAF亚基 BAF250a、BAF60c、BAF180 和 BAF200 在心脏中的表达水平更高,这表明SWI/SNF复合物的这些亚基对心脏早期发育具有非常重要的作用[27]。

Brg1在心肌细胞发育中发挥重要作用,而BAF60c亚基能促进Brg1与转录因子TBX4、GATA4和Nkx2.5之间的相互作用,上调BAF60c、TBX5和GATA4的表达可以诱导非心脏中胚层细胞分化为跳动的心肌细胞。在心肌祖细胞中敲除Brg1基因,会造成心肌细胞的增殖障碍,从而导致严重的心脏缺陷,包括右心室发育不良、心肌变薄、流出道缩短、间隔缺损,基因敲除小鼠通常于胚胎期第10.5～11.5天死亡[31]。BAF60c是心脏结构和功能基因表达的重要调节因子,BAF60c敲除小鼠胚胎的心脏发育不全,导致心脏功能障碍,包括心室壁变薄、心房隔膜减少、肌小梁发育不良、室间隔以及房室垫缺损,该类小鼠多于胚胎期第14.5天前死亡。心肌细胞中BAF60c的条件性缺失导致小鼠出生后形成扩张型心肌病,心脏收缩功能受损[32]。

BAF250a基因对心脏前体细胞分化为成熟的心肌细胞至关重要,BAF250a基因敲除小鼠与Brg1基因敲除小鼠的表型类似,包括右心室发育迟缓、肌小梁形成减少、室间隔和流出道形成缺陷,最终导致基因敲除小鼠于胚胎期第13天死亡。研究人员在BAF180敲除小鼠模型中观察到多种心脏发育缺陷,主要为心室发育不良和间隔缺损,同时冠状动脉的形成受到影响,这类小鼠多于胚胎期第12.5～15.5天死亡[31]。

4 microRNAs与心脏发育

microRNAs是长度为19～25个核苷酸的非编码RNA,它们可以与靶mRNA的3′端结合,并根据互补的程度,抑制或降解mRNA序列,从而影响mRNA的稳定性和翻译。研究表明,microRNAs的时空分布在心脏发育中发挥重要调控作用。例如,在人类胚胎至新生儿期的发育过程中,心脏和骨骼肌的miR-1和miR-133的表达增加[33～34]。而miR-1在果蝇中的缺失是致死的,会导致肌球蛋白重链基因MHC的严重缺陷。现有研究已经确定,miR-1的许多靶点都对心脏发育很重要,包括 HDAC4、Hand2、GJA1(编码 connexin 43)和KCNJ2(编码钾通道亚基Kir2.1)[35]。在心脏发育过程中,心脏动作电位的产生及其传播对于房室协调收缩的启动至关重要,miR-1和miR-223-3p可以通过靶向Kcnd2(编码电压门控通道Kv4.2)转录本调节心脏动作电位[35～36]。miR-133也是心脏发育的重要调控因子,miR-133缺失会使成年心肌病患者出现心肌纤维化、心肌收缩力异常、心肌病和异常增殖等症状[37]。miR-122已被证明可促进心血管系统的细胞凋亡、炎症、纤维化和病理性肥大,从而引起心血管纤维化和心脏功能障碍,最终导致高血压、动脉粥样硬化、心肌梗死和心力衰竭[38]。miR-499是一种心肌特异性microRNA,与人心肌细胞祖细胞(human cardiomyocyte progenitor cells,hCMPCs)一起培养时可诱导其分化[39]。其他心脏特异性microRNAs包括miR-206和miR-208。miR-208缺失导致心脏重构失败,同时也会引起心脏纤维化和肥厚生长[40]。

有研究还从发育的鸡胚心脏中获得了3种鸡特异性的心脏发育相关的新microRNA序列,包括 gga-mir-N2、gga-mir-N12 和 gga-mir-N16[41]。其中gga-mir-N2的靶基因是CACNB2和CACNA1D。CACNB2编码心脏电压门控钙通道亚单位,与房颤[42]有关。gga-mir-N12作用于蛋白磷酸酶 1cγ (protein phosphatase 1cγ,PPP1CC)、钙调蛋白1(calmodulin 1,CALM1)和真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E,EIF4E)基因,它们与胰岛素信号通路相关。gga-mir-N16与Wnt信号通路之间存在显著的关联[41],而Wnt信号调节心脏发生的多个方面,包括心脏规范、心肌细胞增殖和瓣膜形成。这些microRNAs还包括其他几个潜在靶点,如分泌型金属蛋白酶家族(secreted metalloproteases,ADAMTS)成员 ADAMTS17、胰岛素生长因子结合蛋白2[insulin-like growth factor(IGF)binding protein 2,IGFBP2]等,它们都被报道与心血管疾病有关联[43]。

5 心脏疾病的表观遗传机制

心脏疾病包括各种先天性心脏病和后天由其他疾病或环境导致的心脏功能衰退及心力衰竭等疾病。这些心脏疾病都可能存在表观遗传修饰的调控,目前研究报道比较集中的主要是以下几种心脏疾病。

5.1 动脉粥样硬化

动脉粥样硬化是一种慢性病,当血管内皮细胞的功能发生障碍时,脂质在血管内积聚,导致脂肪斑块形成[44]。这些斑块可以发生在全身血管系统的任何地方,是冠状动脉疾病(coronary artery disease,CAD)、冠心病(coronary heart disease,CHD)、缺血性中风和外周动脉疾病的主要原因[45]。据文献报道,表观遗传修饰,尤其是DNA甲基化和microRNAs的调控,对动脉粥样硬化的进展有重要影响[46](表2)。

表2 动脉粥样硬化的表观遗传机制Table 2 The epigenetic mechanism of atherosclerosis

针对动脉粥样硬化病变样本进行的全基因组检测显示,一些特异基因存在明显的甲基化改变,如ATP结合盒转运体A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)、金属肽酶抑制剂1(metallopeptidase inhibitor 1,TIMP1)、二甲基精氨酸二甲氨基水解酶2(dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2,DDAH2)、细胞凋亡蛋白的抑制剂1(cellular inhibitor of apoptosis protein 1,cIAP-1)、缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF1α)等一系列涉及胚胎生长、糖脂代谢、血管反应、凝血和炎症的基因[44]。

一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS3)基因编码内皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)。在生理条件下,NOS3启动子在人内皮细胞中的甲基化水平降低或缺失,而在非内皮细胞,如平滑肌细胞中,该基因启动子的甲基化程度显著增加。但在动脉粥样硬化患者中,内皮细胞呈现eNOS启动子的DNA高甲基化,而平滑肌细胞则呈现eNOS启动子的低甲基化[47]。上述特异性靶基因甲基化状态的改变可能影响动脉粥样硬化形成。最新研究表明,中药制剂和复方可以通过调节DNA甲基化,影响动脉粥样硬化相关基因的mRNA或蛋白质的表达水平,表明中草药可以通过调节DNA甲基化抑制动脉粥样硬化的形成[48]。

此外,一项研究发现,H3K9me3在炎症和血管疾病的表观遗传调控中具有功能。在晚期动脉粥样硬化斑块中,H3K27me3普遍增加[49]。在受动脉粥样硬化斑块影响的人类主动脉中,肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)和白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)通过H3K9me3诱导Rap1 相互作用因子1(Rap1-interacting factor 1,RIF1)低表达[50]。在病理条件下,H3K9me3可能还诱导了ASK1-相互作用蛋白-1(ASK1-interacting protein-1,AIP1B)的表达,从而增强氧化应激和炎症反应,促进血管重构[50]。另一项研究表明,HAT系统在炎症条件下介导人体巨噬细胞中NOX5(NADPH oxidase 5)的表达,并通过NOX5上调动脉粥样硬化中失调的组蛋白乙酰化[51]。HDAC9的缺乏可促进患者炎症反应的消退,逆转胆固醇的转运,阻断动脉粥样硬化进展,诱导疾病消退[52]。

一些microRNAs也被报道参与动脉粥样硬化的发展或调控。miR-126是内皮细胞中表达量最高的microRNAs之一,它在血管系统中通过靶向血管内皮生长因子信号发挥动脉粥样硬化保护作用[53]。miR-181b可以抑制血管内皮细胞核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的活性,导致血管细胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule,V-CAM)和E-选择素的表达下降[54],从而阻止动脉粥样硬化的进展。miR-10a可以负调控血管内皮细胞中NF-κB的活化,从而减弱有丝分裂活化激酶7(mitogen-activated kinase 7,MAP3K7)和转化生长因子-β (transforming growth factor-β,TGF-β)活化激酶1(TGF-β activated kinase 1,TAK1)介导的NF-κB去抑制作用[55]。miR-33也能促进动脉粥样硬化的形成,它通过靶向ATP结合盒(ATP-binding cassette,ABC)转运蛋白,减弱胆固醇的外排,导致血脂异常[56]。

心脏和循环系统的microRNAs已经成为脂质稳态的相关调节因子。有研究调查了冠心病患者循环系统的microRNAs水平,结果表明,在阻塞性冠心病患者中,let-7c-5p、miR-765、miR-483-5p、miR-31-5p和miR-206的表达上调。而在冠状动脉严重狭窄患者中,miR-765、miR-675-3p、miR-433-3p和miR-93-5p的表达显著升高,它们甚至可作为预测冠心病严重程度的指标[57～58]。有报道称,在同一急性心肌梗死患者亚组中,miR-423-5p在急性心肌梗死发生后24 h内显著下调,而在急性心肌梗死发生6个月后表达升高。因此,血浆和血细胞中miR-423-5p的表达水平可能成为冠心病患者风险分级的一个新的生物标志物[59]。还有报道称,同时上调miR-22-5p和miR-150-3p并下调miR-132-5p,可能有助于早期发现急性心肌梗死,从而提高目前的诊断效能[60～61]。因此,microRNAs可能作为新的心脏疾病治疗靶点和预测冠心病的生物标志物。

5.2 心力衰竭

心力衰竭(heart failure,HF)是心室充盈或血液排出结构和功能损害导致心脏无法维持足够的血液流向身体[62],是多种心血管疾病如高血压、瓣膜病、心肌病、心律失常、肺部疾病、缺血性心脏病等发展的最终结果。根据左心室射血分数(ejection fraction,EF)的数值,心力衰竭分为3种不同的表型形式:EF降低的HF(heart failure with reduced ejection fraction,HFrEF),EF<40%;EF平均的HF(heart failure with mid-range ejection fraction,HF-mrEF),EF在40%～49%;EF保留的HF(heart failure with preserved ejection fraction,HFpEF),EF＞50%[63]。在HFmrEF患者分离的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMNCs)中,钠尿肽A(natriuretic peptide A,NPPA)和NPPB的基因启动子的DNA低甲基化,从而导致患者心房钠尿因子(atrial natriuretic factor,ANF)和脑钠尿肽(brain natriuretic peptide,BNP)的蛋白质产物上调[64]。在晚期心力衰竭患者中,DNA甲基化差异存在于上调基因的启动子中,而不存在于下调基因的启动子中[44]。

心力衰竭患者的组蛋白修饰也发生改变。有报道称,HDAC3和DNMT1在心肌细胞肥大诱导的心力衰竭大鼠模型中高表达。HDAC3通过去乙酰化修饰DNMT1,促进DNMT1的表达。DNMT1通过启动子区域的甲基化抑制含Src同源域2的酪氨酸磷酸酶-1(Src homology domain 2-containing tyrosine phosphatase-1,SHP-1)的表达,进而导致心肌细胞肥大诱导的心力衰竭的发生[65]。类泛素修饰剂(small ubiquitin-like modifiers,Sentrin/SUMOs)是一种新型的类泛素蛋白质,它能对大量蛋白质进行共价修饰。许多证据表明,Sentrin/SUMO特异性蛋白酶(Sentrin/SUMO-specific proteases,SENPs)诱导的去SUMO化,在决定蛋白质的SUMO化状态和活性方面起着至关重要的作用。SENP1上调在心肌细胞对肥厚刺激的反应中起作用,SENP1激活心脏过氧化物酶体增殖激活受体共激活因子-1α(cardiac peroxisome proliferator-activated receptor coactivator-1α,PGC-1α)的表达,而PGC-1α是一个强有力的线粒体基因。线粒体网络的失调会导致肌节结构的缺失、心肌病和心力衰竭,SENP1基因的过表达可能通过改变线粒体的功能而导致心力衰竭发生[66]。

同样,一些microRNAs的表达差异也可以区分HFrEF和HFpEF的表型。例如:在HFrEF和HFpEF 中,miR-30c、miR-125a-5p、miR-190a、miR-146a、miR-221、miR-328、miR-375、miR-550a-5p和miR-638都出现差异表达[67]。HFpEF患者有效的运动康复可能会对miR-126的血浆水平产生积极影响,因此miR-126可能是评估HFpEF患者运动康复疗效的潜在生物标志物[68]。针对心力衰竭末期患者的研究发现,miR-340是心力衰竭发生和发展的关键因素[69]。此外,miR-181b可能是心力衰竭的潜在生物标志物,可为心力衰竭的治疗提供新的靶点[70]。还有报道称,细胞质核酸内切酶(cytoplasmic endonuclease,Dicer)的缺失可诱导扩张性心肌病和心力衰竭的发生[71]。

5.3 心肌缺血

心肌缺血(myocardial ischemia)是指心脏血流灌注减少,心肌细胞供氧不足,能量代谢发生异常,导致心肌部分梗死的疾病。表观遗传调控参与多种缺血性心脏病的发生过程,对心肌缺血的诊断和治疗具有重要作用。

在心肌缺血过程中,血清及心脏组织中的全基因组甲基化水平明显升高,心脏组织中DNA甲基化水平的异常会加重心肌缺血[72]。有研究发现,冠心病患者外周血淋巴细胞中的全基因组甲基化水平升高;基于鼠、兔等动物心肌缺血模型的研究表明,心肌缺血时,血液细胞中的全基因组甲基化水平也明显升高,因此全基因组甲基化水平可以作为心血管疾病诊断和预测的生物标志物[73]。在冠心病患者血样中,TIMP1、ABCA1和乙酰辅酶A乙酰转移酶1(acetyl-CoA acetyltransferase 1,ACAT1)的甲基化水平与正常人相比明显升高,提示这些特定基因的甲基化在心肌缺血过程中发挥重要作用[74]。DDAH2启动子区的甲基化水平的升高,会明显加重心肌缺血后的心脏损伤[75]。有研究报道,尼古丁会加重大鼠心肌缺血造成的左心室损伤,DNA甲基化抑制剂5-Aza(5-azacytidine)能显著逆转尼古丁引起的心肌缺血损伤,增加冠状动脉血流量,对心肌缺血起到治疗作用[76]。

大多数HDACs会加重心肌缺血造成的损伤。有研究发现,Ⅲ类HDACs中的线粒体NAD+依赖性赖氨酸去乙酰化酶(mitochondrial NAD+dependent lysine deacetylase,SIRT)家族中的SIRT 1～6对心脏具有保护作用[77]。SIRT1敲除小鼠的心脏会丧失心肌内源性保护,加重心肌缺血造成的损伤。缺血再灌注或是急性心梗后,过表达SIRT1会使心肌梗死面积减小。SIRT1主要是通过抑制心肌细胞促凋亡因子Bax(B-cell lymphoma 2 associated X)、胱天蛋白酶-3(caspase-3)的表达,促进Bcl-xL(B-cell lymphoma-extra large)等基因的表达,改善氧化应激,进而保护心肌功能。在小鼠心脏缺血再灌注模型中,SIRT3敲除小鼠的心脏功能恢复困难,梗死面积增大[78]。SIRT3的缺失会导致线粒体膜的通透性增强,Ca2+严重超载,心脏功能完全丧失恢复能力;下调SIRT5的表达会使心肌梗死面积增大,过表达SIRT5则能够减轻心肌缺血造成的心肌细胞损伤,缓解线粒体呼吸链的紊乱情况[79]。

在心肌缺血过程中,microRNAs也参与细胞凋亡、氧化应激及Ca2+超载等损伤机制。在大鼠心肌缺血再灌注模型中,miR-22的表达明显下调,过表达miR-22会使心脏梗死面积减小,左心室功能增强,冠状动脉的血流量明显升高。进一步研究发现,miR-22通过抑制Bax、p53等凋亡因子的表达改善心肌功能[80]。在心肌缺血过程中,线粒体功能发生障碍,而miR-15a/b可以调节细胞能量代谢,抑制心肌损伤[81]。上调miR-145的表达可以改善氧化应激损伤,恢复心肌功能,同时,miR-145还参与了心肌缺血后的Ca2+超载过程[82]。此外,miR-1298的过表达显著减少了心肌缺血再灌注大鼠心脏的梗死面积,降低了心肌细胞凋亡速率[83]。miR-214可以减轻心肌细胞内的Ca2+超载,缓解心肌损伤,恢复左心室功能[84]。在心肌缺血过程中,细胞自噬水平增加,过度自噬会加重心肌损伤。研究报道,miR-221可以减少细胞自噬,保护缺血损伤后的心肌细胞[85]。

5.4 心肌纤维化

心肌纤维化(myocardial fibrosis)是指心肌细胞外基质纤维化蛋白质的过度沉积会形成瘢痕组织,导致心壁硬度增加,心肌舒张功能障碍,从而影响心肌组织的功能。持续的纤维化会降低心肌组织的顺应性,加速心力衰竭的发生。当心脏暴露在压力负荷、心肌梗死等病理条件下时,为了维持心脏的正常结构,心肌成纤维细胞会激活增殖,其分泌的纤维化蛋白质在细胞外基质过度沉积,最终致使心衰的发生[86]。近年来的研究发现,表观遗传调控多种与心肌纤维化相关的基因表达。

多种基因的DNA甲基化在心肌纤维化的发生中发挥作用。在缺氧的条件下,缺氧诱导因子HIF-1α可以诱导DNA超甲基化,促进DNMT1、DNMT3B的表达。TGF-β通过经典的TGF-β/smad通路,上调多种纤维化相关基因的表达,促进心肌纤维化,而DNMT抑制剂则可以抑制TGF-β的促纤维化作用[87]。有研究表明,心肌成纤维细胞增殖激活的过程会降低RASSF1A基因(tumor suppressor gene)的表达,增加DNMT3A的表达,并且DNMT3A抑制RASSF1A基因的表达,最终导致心肌纤维化的发生[88]。据报道,过度的细胞自噬会加剧心肌纤维化,DNMT3A抑制miR-200b的表达,促进主动脉缩窄小鼠心脏细胞自噬的发生[89]。miR-369-5p下调DNMT3A的表达,抑制心肌纤维化的发生[90]。Ras蛋白激活剂1(Ras protein activator like 1,RASAL1)的启动子区域超甲基化,促进Ras信号通路激活,从而引起心肌纤维化,TET(ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase)则通过诱导RASAL1启动子去甲基化减轻心肌纤维化[91]。

另有报道显示,CTRP3(C1q and TNF related 3)抑制组蛋白乙酰转移酶p300与TGF-β家族受体下游的信号转导分子Smad3之间的作用,从而降低心肌纤维化[92]。赖氨酸乙酰转移酶(lysine acetyltransferase 8,KAT8/MOF)是心肌纤维化中重要的调节因子,可以激活NOX的转录,敲除MOF可显著降低缺氧诱导的心肌梗死及纤维化面积[93]。选择性抑制Ⅰ类HDACs,能阻断心肌成纤维细胞的细胞周期进程,从而抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌纤维化水平[94]。H3K9特异性甲基转移酶(H3-K9-specific methyltransferase,G9a)能够催化H3-K9甲基化,G9a的敲除会增加心肌纤维化水平,加剧心肌肥厚[95]。研究发现,赖氨酸脱甲基酶4A(lysine demethylase 4A,KDM4A)的缺失,能够改善主动脉缩窄小鼠的心肌纤维化程度[96]。

在人及小鼠心肌纤维化发生中,miR-125b的表达显著增加,抑制miR-125b的表达可以降低血管紧张素Ⅱ诱导的心肌纤维化程度[97]。抑制主动脉缩窄小鼠中miR-21的表达可以抑制心肌间质纤维化,减轻心功能障碍[98]。心梗后,心脏巨噬细胞过表达miR-21可以降低心肌纤维化水平[99]。当心脏暴露在压力负荷、心肌梗死等病理条件下时,miR-25和miR-29等促进心肌纤维化,而miR-101a/b和miR-378等抑制心肌纤维化的进程[99]。因此,探索microRNAs调控心肌纤维化的病理过程,有助于发现心肌纤维化的诊断标志物或者治疗靶标。

6 食用表观遗传活性功能食品对心脏的保护作用

食物对人类表观基因组的影响已经成为一个新的研究热点,甚至有研究发现:每天食用经科学证明对健康有益的功能性食品或摄入表观遗传活性化合物,可降低死亡风险并预防心力衰竭和其他心血管疾病[100]。

前面述及,DNMTs和HNMTs是DNA和组蛋白甲基化调节的关键酶类[101],它们都是利用线粒体S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)产生甲硫氨酸,继而产生腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH),后者再转化为同型半胱氨酸(homocysteine,HCY)。SAM是有效的甲基供体,而SAH是DNMTs和HNMTs活性的有效调节剂。膳食叶酸和维生素B1是HCY转化为甲硫氨酸所必需的,并可能调节染色质甲基化。叶酸水平过低和血清HCY水平过高与心血管疾病患者甲基化程度高、冠心病及血管功能障碍有关[102]。而豌豆、动物肝脏和强化的早餐谷物都含有叶酸和维生素B1。

HATs催化乙酰基从乙酰辅酶A转移到组蛋白的赖氨酸残基上,易受糖酵解或组蛋白赖氨酸残基浓度的影响,因为乙酰辅酶A和β-羟基丁酸酯都是由丙酮酸衍生而来。研究发现,膳食化合物,如姜黄素、儿茶素、染料木素、二烯丙基二硫化物,可以调节HATs活性,而β-葡聚糖、萝卜硫素、姜黄素、丁酸盐、白藜芦醇、槲皮素可以调节HDACs的活性[101]。肠道微生物的纤维发酵可增加丁酸水平[103],而大麦β-葡聚糖[barley-derived(1.3)β-D-glucan,BBG]可抑制Ⅰ类HDACs,并增加培养的人内皮细胞中的线粒体抗氧化状态[104]。在体内,定期摄入含3%BBG的意大利面可通过激活促血管生成机制和线粒体自噬,保护缺血再灌注小鼠心脏[105]。

NAD+是细胞氧化还原反应期间产生的一种辅酶,它调节Ⅲ类HDACs,即SIRTs。SIRTs通常在动物模型和人类中都具有心脏保护作用。烟酰胺核苷(一种牛奶中富含的NAD+前体)可以促进SIRT1活性,从而预防败血症小鼠的心脏损伤[106]和老年人的动脉僵硬。

流行病学和随机临床试验初步发现:食用传统的天然食品可通过表观遗传机制对心脏产生保护作用(表3)。例如,食用坚果与心血管死亡风险降低有关,原因是经常摄入坚果可以改变肠道微生物群DNA甲基化水平[107]和丁酸产量的变化,改善内皮功能以及血脂分布。当然,由于遗传差异,肠道微生物群对类似膳食纤维摄入量的反应在不同个体之间具有差异性。有报道显示,磨细的亚麻籽可显著降低血压和胆固醇水平,减轻炎症,改善血管舒张[108]。同样,人体每天摄入3～5 g植物葡聚糖可以降低低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)-胆固醇和餐后血糖水平,这与相对分子质量较高的β-葡聚糖可以增加类杆菌、产生丙酸(HDACs抑制剂)从而提高降胆固醇效果有关[109]。野生浆果和一些野生绿色蔬菜(如马齿苋、石蕊)富含丙氨酸,核桃、油菜籽和特级初榨橄榄油中也含有丰富的丙氨酸,适量增加丙氨酸的摄入量对心脏有保护作用[110]。

表3 功能性食品的心脏保护效应Table 3 Cardioprotective effects of functional foods

很多报道显示,红酒中的多酚(即白藜芦醇、花青素、原花青素、杨梅素、槲皮素和单宁)、啤酒中的有效成分(即酚酸、前烯基查尔酮、黄酮、儿茶素和花青素)、可可中的黄烷醇和黄酮醇以及咖啡多酚(咖啡酸和绿原酸)都具有表观遗传活性,是人类DNMTs的有效抑制剂,可通过改善血脂、内皮功能和血压来保护心脏[111～113]。

虽然上述实验和临床数据表明,生物活性食品可以调节心脏保护基因的表达,但是评估传统食品功能的临床试验与涉及药物的临床试验不同,因为食物成分及其浓度、食品加工方式与程度、生物转化量及代谢等诸多方面与各种表观遗传因素的相互作用很难定量界定,所以表观遗传活性化合物对心脏的保护作用还有待更准确地评估。

7 结语

本文综述了心脏发育和心脏疾病表观遗传机制的最新研究成果,其中DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑复合物和microRNAs在心脏发育中发挥重要作用。DNMTs介导的DNA甲基化修饰失衡,以及一些心脏发育调控基因启动子区甲基化水平的改变,会导致心脏发育异常。催化组蛋白乙酰化、去乙酰化、甲基化等相关酶的缺失会造成心脏发育缺陷,甚至会导致胚胎致死。染色质重塑复合物是由具有ATP酶依赖性的功能亚基组成,这些功能亚基的异常表达或缺失也会造成心脏发育缺陷。microRNAs参与转录后水平的表观遗传调控机制,其时空分布在心脏发育中发挥重要的调控作用。

动脉粥样硬化病变中存在明显的基因组甲基化改变,组蛋白甲基化和乙酰化在动脉粥样硬化的形成过程中也发挥作用,此外,一些microRNAs可以促进或阻止动脉粥样硬化的形成,并且可能是心脏疾病新的治疗靶点。心力衰竭是多种心血管疾病发展的最终结果,心力衰竭患者的DNA甲基化水平和组蛋白修饰发生改变,一些micro-RNAs的表达差异可以区分心力衰竭患者的表型。在心肌缺血过程中,血清及心脏组织中的全基因组甲基化水平明显升高,大多数HDACs会加重心肌缺血造成的损伤。同时,microRNAs也参与心肌缺血后的损伤机制。多种基因的DNA甲基化以及组蛋白修饰酶在心肌纤维化的发生中发挥作用,microRNAs在心肌纤维化的病理过程中的表达发生改变。

当前,大多数心脏发育和心脏疾病表观遗传调控机制的研究热点是识别细胞特异性的表观遗传调控靶点,以获得心脏疾病的预防机制。表观遗传活性功能食品的心脏保护作用为心脏发育的机制研究和心脏疾病的治疗方向提供了新的视角。虽然临床数据强烈支持有效的饮食干预在心血管疾病保护中的作用,但是现在人们面临的挑战是需要进一步确定不同饮食模式下心脏表观基因组的适应性调节机制。一些创新性的生物信息学工具,可以识别心血管疾病潜在的基因和分子调控网络,从而为患者的精准诊断和个性化治疗开辟新领域。但是,这些众多的表观遗传修饰机制在诱导心脏发育和心脏疾病的过程中,是协同还是竞争？与哪些因素有关？这些问题仍亟待解决。