基于cGMP-PKG/PKA信号通路探究奥扎格雷对ACI模型大鼠认知功能的干预机制

高飞, 姚淑芳, 陶有亮

三门峡市中心医院 1药学部， 2神经内科(河南三门峡 472000)； 3三门峡职业技术学院医护学院(河南三门峡 472000)

急性脑梗死(acute cerebral infarction，ACI)是临床上常见的一种脑血管疾病，是由于患者脑供血突然中断而导致的脑组织软化和坏死，具有较高的致残率和病死率，严重影响患者生命健康[1-2]。奥扎格雷作为一种高选择性的TXA2合成酶抑制剂，可有效促进前列环素的生成，进而抑制各种炎性因子的分泌，可扩张患者的脑血管，增加脑梗死区域的血流量，加快患者受损脑组织恢复进程[3]。环磷酸鸟苷-蛋白激酶G(cGMP)是细胞内普遍存在的第二信使，主要作用于三磷酸鸟苷，在脑卒中患者中激活的cGMP可促进蛋白激酶G(PKG)活性的增强，进而对梗死组织起到一定的保护作用[4-5]。蛋白激酶A(PKA)在神经元突触及生长中起着重要的作用[6]。鉴于此，本研究于2020年1月至2021年3月选取32只清洁及健康的雄性昆明大鼠，研究基于cGMP-PKG/PKA信号通路探究奥扎格雷对ACI模型大鼠认知功能的干预机制。本研究经医院伦理委员会审核通过。

1 材料与方法

1.1 材料 选取32只清洁及健康的雄性昆明大鼠，鼠龄为2～3个月，平均(2.63±0.22)个月，体重为200～300 g，平均(237.50±47.50)g，大鼠均购自中科院上海实验动物中心，许可批号：SCXK(沪)2003-0002。大鼠的饲养环境为：温度27℃，湿度70%，自由饮食饮水。

1.2 方法

1.2.1 ACI模型大鼠的建立 从清洁及健康的32只大鼠中随机选取24只建立ACI模型，腹腔注射40 mg/100 g水合氯醛，麻醉后沿大鼠颈部中线切开皮肤，暴露大鼠的右侧颈总动脉，然后夹闭颈内动脉，在颈总动脉处剪一个小切口，切口处插入线栓，然后将线栓经大鼠颈内动脉处伸入大脑前动脉，直至出现阻力。建模大鼠神经行为学分级达到Ⅰ级以上说明模型建立成功[7]。

1.2.2 分组 建模的24只大鼠分为模型组、低剂量奥扎格雷组、高剂量奥扎格雷组，各8只，未建模的8只为正常组，模型组注射生理盐水，低剂量奥扎格雷组注射4 mg/(kg·d)的奥扎格雷，高剂量奥扎格雷组注射8 mg/kg的奥扎格雷，所有大鼠连续干预2周。

1.2.3 认知功能检测 采用Morris水迷宫实验检测各组大鼠逃避潜伏期、穿越平台次数、平台停留时间，定位航行实验观察大鼠从4个象限入水后找到平台的潜伏期，第6天开始空间探索实验，撤去平台，然后将大鼠从同一入水点放入水中，记录大鼠穿越平台次数及平台停留时间。

1.2.4 脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)水平检测 在大鼠隐静脉处进行采血，待大鼠固定后，将后腿外侧区域剃毛后暴露采血点，将采血针刺入采血点，采集1 mL的血液，分离上层血清，用酶联免疫法检测BDNF、NGF水平，先将BDNF、NGF稀释，设置空白孔和待测样品孔，将40 μL 各因子稀释液加入酶标包被板上的待测样品孔中，用封板膜进行封板，在37℃下温育30 min，撕掉封膜板，弃去液体，甩干，每个孔中加满洗涤液，静置1 min，重复3次，每个孔中加入50 μL的酶标试剂，温育、洗涤，加入显色剂，混匀，37℃下避光显色30 min，加入50 μL Na2HPO4终止反应，在波长450 nm酶标仪上读取各孔的吸光度，并准确记录BDNF、NGF水平。

1.2.5 大鼠梗死面积检测、神经功能评分评估 采用线栓法评估大鼠神经功能缺损，0分为无神经功能缺损，不能伸展对侧前爪为1分，大鼠身体向对侧转圈为2分，向手术对侧倾倒为3分，不能自动行走、意识丧失为4分。大鼠麻醉后迅速断头取脑，将前脑冠状切成2 mm厚的脑片，在0.5%氯化三苯基四氮唑溶液中染色10 min，然后使用10%甲醛溶液固定，染色结束后正常组织呈白色，梗死组织呈红色，使用软件分析梗死范围。

1.2.6 病理学观察 将大鼠的脑组织放置在冰盒上，在-25℃下速冻20 min，然后用刀片去除大鼠脑组织的嗅球和小脑部分，从脑前极开始进行冠状切片，片厚2 mm，使用10%甲醛溶液固定，在氯化三苯基四氮唑溶液中染色处理，在37℃的烘箱中避光孵育25 min，10 min后将脑片翻面，显微镜下观察病理学。

1.2.7 cGMP、PKG、PKA蛋白检测 Western blot法检测cGMP、PKG、PKA蛋白，将取出的脑组织超声粉碎，加入1 mL的RIPA裂解液和10 μL的PMSF，取上清液加入蛋白上样缓冲液，在100℃下变性15 min，然后将样品进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，每个孔中加入40 μg的总蛋白，电泳结束后将蛋白转移到PVDF膜上，转膜时间为60 min，5%脱脂奶粉封闭60 min，然后加入cGMP、PKG、PKA的一抗抗体，在4℃下过夜，第2天取出后在37℃下放置60 min，TBST洗膜3次，15 min/次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，在37℃下孵育1 h，TBST洗膜3次，15 min/次，然后加入ECL暗室曝光，利用Image J软件扫描条带灰度值，计算cGMP、PKG、PKA的量，以GAPDH为内参蛋白。

2 结果

2.1 奥扎格雷对ACI模型大鼠认知功能的影响 与正常组大鼠相比，模型组、低剂量奥扎格雷组、高剂量奥扎格雷组逃避潜伏期较多，穿越平台次数、平台停留时间少(P<0.05)；与模型组大鼠相比，低剂量奥扎格雷组、高剂量奥扎格雷组大鼠逃避潜伏期较少，穿越平台次数、平台停留时间较多(P<0.05)。见表1。

表1 奥扎格雷对ACI模型大鼠认知功能的影响

2.2 奥扎格雷对ACI模型大鼠梗死面积、神经功能评分的影响 与正常组大鼠相比，模型组、低剂量奥扎格雷组、高剂量奥扎格雷组大鼠梗死面积、神经功能评分较高(P<0.05)；与模型组大鼠相比，低剂量奥扎格雷组、高剂量奥扎格雷组大鼠梗死面积、神经功能评分较低(P<0.05)。见表2。

表2 奥扎格雷对ACI模型大鼠梗死面积、神经功能评分的影响

2.3 奥扎格雷对ACI模型大鼠BDNF、NGF水平的影响 与正常组大鼠相比，模型组、低剂量奥扎格雷组、高剂量奥扎格雷组大鼠BDNF、NGF水平较低(P<0.05)；与模型组大鼠相比，低剂量奥扎格雷组、高剂量奥扎格雷组大鼠BDNF、NGF水平较高(P<0.05)。见表3。

表3 奥扎格雷对ACI模型大鼠BDNF、NGF水平的影响

2.4 各组大鼠病理学观察 正常组大鼠脑组织脑细胞排列整齐，无水肿现象；模型组大鼠脑组织水肿、脑细胞排列紊乱、细胞核仁模糊、小胶质细胞数量增多；低剂量奥扎格雷组大鼠脑组织水肿减小，小胶质细胞数量增多；高剂量奥扎格雷组脑细胞排列基本整齐，与正常组大鼠基本相似。见图1。

注:A:正常组;B:模型组;C:低剂量奥扎格雷组;D:高剂量奥扎格雷组

2.5 奥扎格雷对ACI模型大鼠cGMP、PKG、PKA蛋白的影响 与正常组大鼠相比，模型组、低剂量奥扎格雷组、高剂量奥扎格雷组大鼠cGMP、PKG水平较高，PKA水平较低(P<0.05)；与模型组大鼠相比，低剂量奥扎格雷组、高剂量奥扎格雷组大鼠cGMP、PKG水平较低，PKA水平较高(P<0.05)。见表4和图2。

图2 cGMP、PKG、PKA蛋白Western blot检测

表4 奥扎格雷对ACI模型大鼠cGMP、PKG、PKA蛋白的影响

3 讨论

ACI是临床上常见的一种脑血管疾病，常发生于中老年人群中，该病与患者脑动脉狭窄、血液流动力学改变、血液成分异常、微栓子脱落、血管内皮损伤等因素有关[8]，ACI患者由于脑部供血不足再加上严重缺氧，会严重损伤患者的神经元细胞进而出现认知功能障碍的现象[9]。

本研究通过观察大鼠的逃避潜伏期、穿越平台次数、平台停留时间，得出奥扎格雷可有效改善大鼠的认知功能。奥扎格雷对患者神经元具有一定的保护作用，可有效改善患者神经功能缺损和认知功能，降低梗死面积，增加患者脑部缺血区域的血流量，使患者受损脑组织快速恢复[10-11]。研究指出[12]，奥扎格雷在改善患者脑能量代谢与缺血脑区域血流量的过程中，抑制神经元细胞的凋亡和血栓的形成，在抗血小板聚集中起到重要作用。ACI患者认知功能障碍的发生与患者脑部血管病变、脑组织缺血、缺氧密切相关，可对患者的神经组织和脑部认知记忆造成严重的损伤[13-14]。

神经功能缺损评分和梗死面积是评估ACI的两项重要内容，其中大脑中动脉闭塞可导致神经功能严重受损[15-16]。本研究显示，奥扎格雷可明显降低ACI模型大鼠的梗死面积，改善神经功能评分，促进大鼠康复，高剂量奥扎格雷效果更为明显。

BDNF是神经营养因子家族成员之一，可促进神经元的存活和生长，调节突触的可塑性。研究指出[17]，BDNF在维持ACI患者神经元功能、防止神经元退行性病变等过程中发挥重要作用，同时还参与大脑的学习和记忆过程，提示BDNF可反映出大鼠认知功能受损程度。NGF作为一种神经生长因子，可拮抗神经细胞的凋，促进胆碱能神经元功能，诱导轴突末端的生长，保护基底前脑胆碱能神经元，改善记忆能力[18-19]。国外研究指出[20]，BDNF、NGF水平的降低与大鼠认知功能障碍关系极为密切。ACI患者脑部缺血、缺氧、梗死周围去极化、兴奋性氨基酸毒性等一系列问题发生后会影响神经递质的传递功能，损伤患者的神经元，进而影响患者认知功能。本研究显示，奥扎格雷可通过提高大鼠体内BDNF、NGF水平改善大鼠的认知功能。

本研究显示奥扎格雷通过调控cGMP、PKG、PKA蛋白水平来改善大鼠的认知功能。cGMP、PKG是细胞内重要的信号转导通路，参与脑部缺血再灌注损伤过程，当脑部周围神经受损时cGMP、PKG含量会急剧增加，参与ACI发病过程。研究指出[21]，与正常大鼠相比，ACI模型大鼠体内含量较低，推测PKA蛋白的激活是低于脑损伤的重要神经保护机制，在神经元生长、突触的可塑性中起着正向调节作用。

综上所述，高剂量奥扎格雷可通过调控cGMP、PKG、PKA蛋白水平减少逃避潜伏期，增加穿越平台次数及平台停留时间，进而改善大鼠认知功能，减少大鼠梗死面积和神经功能评分，提高BDNF、NGF水平，为临床上治疗ACI提供新的方向。

利益相关声明：所有作者均声明不存在任何利益冲突。

作者贡献说明：高飞负责实验设计、实施和论文撰写；姚淑芳和陶有亮负责实验、数据分析和指导。