新型冠状病毒特异抗体检测假阳性结果多中心分析*

何巍巍, 周会祥, 王文娟, 袁育珺, 罗彦妮, 黄龙, 段训新, 黄会金, 胡修全, 代龙文, 徐肖丁, 王波兰, 陈春辉, 欧阳盛武, 喻文0, 赵德刚, 花蕾, 李建根, 刘峰, 余晓慧, 李年德, 刘文仲, 高明祥, 谌秋华, 赵咏梅0, 冷文学, 何创华, 郭淼生, 胡志坚△

1九江学院附属医院检验科(江西九江 332001)； 2九江学院附属口腔医院(江西九江 332099)； 3九江市妇幼保健院检验科(江西九江 332001)； 4九江市中医院检验科(江西九江 332099)； 5九江市濂溪区人民医院检验科(江西九江 332020)； 6都昌县人民医院检验科(江西九江 332699)； 7都昌县中医院检验科(江西九江 332699)； 8九江市第三人民医院检验科(江西九江 332099)； 9彭泽县人民医院检验科(江西九江 332701)； 10湖口县人民医院检验科(江西九江 332599)； 11庐山市人民医院检验科(江西九江 332899)； 12九江经济开发区人民医院检验科(江西九江 332099)； 13武宁县人民医院检验科(江西九江 332399)； 14九江市第五人民医院检验科(江西九江 332004)； 15瑞昌市人民医院检验科(江西九江 332299)； 16永修县人民医院检验科(江西九江 330399)； 17都昌县妇幼保健院检验科(江西九江 332699)； 18德安县人民医院检验科(江西九江 330499)； 19庐山康复中心检验科(江西九江 332499)； 20共青城市人民医院检验科(江西九江 332020)； 21修水县第一人民医院检验科(江西九江 332499)； 22共青城新市医院检验科(江西九江 332020)； 23修水县中医院检验科(江西九江 332499)

目前在全球范围肆虐的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)入侵人体引起的一种急性呼吸道传染病[1-3]。目前COVID-19诊断的金标准仍然是聚合酶链反应(PCR)法检测病毒核酸，但是由于核酸检测结果受样本采集手法、样本保存条件、PCR 操作过程等因素影响[4]，SARS-CoV-2核酸检测存在一定的假阴性[5-6]。国家卫生健康委员会《新型冠状病毒肺炎诊疗方案 (试行第七版)》确诊病例增加了SARS-CoV-2特异性免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)和免疫球蛋白 G(immunoglobulin G，IgG)抗体检测，作为临床确诊标准[7]。与核酸检测手段相互补充，以弥补核酸检测时出现的假阴性和假阳性[8]，提高疑似病例检测的准确率。本研究的目的是对SARS-CoV-2特异性IgM和IgG抗体的检测阳性结果情况进行分析，特别是针对阳性结果的真阳性、假阳性情况分析以及假阳性产生的原因分析，探讨SARS-CoV-2特异性抗体检测假阳性的可能因素。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性收集2020年3月至2021年1月期间九江地区23家二级及以上医院SARS-CoV-2特异性抗体检测结果和抗体假阳性血清标本，其中：胶体金法(gold immunochromatography assay，GICA)阴性147 021例，阳性134例；化学发光法(chemiluminescence immunoassay,CLIA)IgG抗体阴性25 218例，阳性50例；CLIA法IgM抗体阴性25 223例，阳性23例。本研究经九江学院附属医院伦理委员会批准实施(批件号：jjuhmer-a-2020-01)。由于所纳入试验的检测结果及血清样本检测均以匿名方式进行，九江学院附属医院伦理委员会批准了予以豁免患者知情同意的申请。

1.2 方法

1.2.1 SARS-CoV-2抗体检测 所有研究对象均采集空腹静脉血3 mL，置于含分离胶的黄头真空采血管内，静置待血液凝固，4 000×g离心10 min，取血清备用。GICA法测定试剂盒为广州万孚生物技术股份有限公司生产的抗新型冠状病毒总抗体(不区分IgM和IgG抗体)胶体金试剂，采用胶体金免疫层析技术原理，应用捕获法检测人血清新型冠状病毒抗体；CLIA法测定使用博奥塞斯 Axceed260化学发光测定仪和安图A2000化学发光测定仪及配套SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体检测试剂，两种试剂的临界值(Cut off 值)均为 S/CO ≥ 1 AU/mL。所有标本的采集、处理及检测严格按照试剂说明书要求进行。

1.2.2 SARS-CoV-2核酸检测 按《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册》(联防联控机制医疗发〔2020〕271 号)采集受试者口咽拭子或鼻咽拭子，使用达安基因新冠病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)，严格按仪器操作规程和试剂盒说明书进行检测。

1.2.3 SARS-CoV-2抗体假阳性排查 对1.2.1方法检测SARS-CoV-2抗体阳性结果，各实验室首先进行复查，复查及阳性结果确定流程见图1(GICA法检测的阳性标本实验室使用其他厂家GICA法试剂复查，复查阳性结果再经CLIA法复查；CLIA法测得的阳性结果实验室使用CLIA法、CLIA法双重复查)。复查后阳性结果经过受试者SARS-CoV-2流行病学史、临床表现、SARS-CoV-2核酸检测、病毒感染后抗体产生规律及疫苗接种等原因分析，由各医院专家组结合《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》排除SARS-CoV-2病例的标本再次确定为假阳性结果。收集再次确定为假阳性结果标本(含分离胶的黄头真空采血管内，静置待血液完全凝固，4 000×g离心10 min取血清-70℃保存)，标本均无溶血，通过检测类风湿因子(RF，BECKMAN IMMAGE 800特定蛋白分析仪及配套试剂)、嗜异性抗体(forssman antibody, F.antibody，羊红细胞嗜异性凝集试验)、补体(CH50，SRBC溶血法)、溶菌酶(lysozyme，比浊法)、甲胎蛋白(AFP，BECKMAN DXI800发光仪及配套试剂)、癌胚抗原(CEA，BECKMAN DXI800发光仪及配套试剂)分析假阳性原因，各项目检测均按照检验操作规程进行，复检流程见图1。

图1 SARS-CoV-2抗体检测初检阳性结果复查及阳性结果确认流程

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件进行数据统计和分析。计算各种检测方法假阳性比例、造成假阳性各因素比例以及化学发光法复查阴性和原因不明标本各抗体结果的均数和标准差。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同检测方法检测所得SARS-CoV-2抗体阳性结果情况分析 GICA法检测阳性结果中假阳性比例为0.03%(41/147 062)；CLIA法检测IgG抗体、IgM抗体假阳性比例分别为0.08%(21/25 239)、0.06%(15/25 238),见表1。

表1 SARS-CoV-2抗体检测阳性情况表 例

2.2 SARS-CoV-2抗体结果假阳性原因分析

2.2.1 SARS-CoV-2抗体假阳性标本复检情况分析 实验室按照图1流程对筛检假阳性标本进行复检，结果见表2。 41例GICA法IgM/IgG复合抗体初检阳性结果标本经GICA复检阴性11例、CLIA法定量复检阴性9例，报告阳性标本21例，经CLIA法定量复检，其中单独IgG阳性8例、单独IgM阳性6例、IgG和IgM同时阳性7例；CLIA法IgG和IgM抗体复检后再次确定IgG抗体、IgM抗体单独假阳性标本分别为12例、8例，同时为假阳性标本5例。CLIA法IgG抗体和IgM抗体假阳性标本复检阴性率(19.05%，13.33%)明显低于GICA法检复检阴性率48.78%(2=5.174 6，P<0.05；2=5.785 3，P<0.05)。

表2 SARS-CoV-2抗体假阳性标本复查情况分析 例(%)

2.2.2 SARS-CoV-2抗体再次确定为假阳性标本内源性干扰因素检测 经2.2.1复检结果最后经专家组依据相关证据结合《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》确定为假阳性的标本共46例(IgG抗体、IgM抗体单独假阳性标本分别为20例、14例，IgG和IgM抗体同时假阳性标本12例)，CLIA 法检测32例IgG抗体假阳性结果浓度值为(12.12±8.95) AU/mL，26例IgM抗体假阳性结果浓度值为(15.61±9.78) AU/mL。

46例假阳性的标本进行RF、CH50、F.antibody、lysozyme、AFP、CEA检测，检出RF、CH50、F.antibody、lysozyme、AFP阳性标本分别为27例(58.70%)、7例(15.22%)、7例(15.22%)、3例(6.52%)、1例(2.17%)，其中AFP阳性的样本同时检出CH50阳性，另1例(2.17%)均未检出，结果见表3。不同假阳性因素所致抗体检测结果详见表4，经分析假阳性因素浓度高低与引起抗体检测结果的变化差异无统计学意义。

表3 SARS-CoV-2抗体再次确定为假阳性标本内源性干扰因素检测结果

表4 SARS-CoV-2抗体假阳性因素引起抗体检测结果表

3 讨论

当人体受到SARS-CoV-2感染时，机体免疫细胞受SARS-CoV-2抗原刺激后，被激活而合成、分泌产生特异性IgM、IgG抗体。其中IgM抗体为初次体液免疫应答中最先出现的抗体，一般在急性感染5 d左右产生，可作为机体急性感染早期指标；IgG 抗体为再次免疫应答产生的主要抗体，一般感染14 d左右产生，可作为诊断现症感染和既往感染的指标。因此，IgM和IgG抗体联合检测可以监测患者整个疾病过程中的抗体表达水平。有研究表明：同时检测SARS-CoV-2 IgM和IgG 抗体有助于提高检测的阳性率[9-10]。

自从“新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)”中指出，“血清新型冠状病毒特异性IgM抗体和IgG 抗体阳性；血清新型冠状病毒特异性IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期4倍及以上升高”可以作为确诊的血清学证据以来，作为SARS-CoV-2核酸检测重要补充的特异性IgM和IgG抗体检测，在临床诊断中也被广泛使用。然而，实践过程中SARS-CoV-2特异性IgM和IgG抗体检测与其他抗体检测一样存在干扰因素而导致假阳性结果，干扰的因素包括检测试剂的抗干扰能力、外源性干扰和内源性干扰，为此“新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版修订版)”[11]指出，由于试剂本身阳性判断值原因、或者体内存在干扰物质(RF、F.antibody、CH50、lysozyme等)、或者标本原因(标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存时间过长、标本凝固时间不全等)，抗体检测可能会出现假阳性，一般不单独以血清学检测作为诊断依据，需要结合流行病学史、临床表现和基础疾病等情况进行综合判断。

本研究统计各实验室初次SARS-CoV-2特异性抗体检测结果：GICA法(IgG/IgM)复合抗体假阳性率为0.03%(41/147 062)，CLIA法IgG抗体假阳性率为0.08%(21/25 239)，CLIA法IgM抗体假阳性率为0.06%(15/25 238)，较肖秀美等[12]报告GICA 法IgG和IgM总抗体3种试剂检测假阳性率分别为0.55%(3/548)、4.2%(23/548)和0.73%(4/548)均低，可能与本次是大样本量分析有关。对初次检测假阳性样本，通过延长离心时间、选择不同检测方法进行复查，可排除GICA法IgG/IgM抗体48.78%的假阳性结果、CLIA法IgG抗体19.05%的假阳性结果、CLIA法IgM抗体13.3%的假阳性结果，表明GICA法较CLIA法检测试剂的抗干扰能力和抗外源性干扰的能力较差，实验室通过建立SARS-CoV-2特异性抗体检测阳性结果复检与审核规范，采用延长离心时间和使用不同检测试剂、方法进行复查可较好排除外源性干扰和检测试剂因素导致的假阳性结果，减少实验室发出假阳性结果的数量，减轻临床负担。

内源性干扰是常规实验室抗体检测较难排除的因素，本研究对46例经临床诊断再次确定为SARS-CoV-2抗体假阳性的标本，检出RF、CH50、F.antibody、lysozyme、AFP阳性标本分别为27例(58.70%)、7例(15.22%)、7例(15.22%)、3例(6.52%)，RF引起的假阳性肖秀美等[12]报告不同浓度RF致SARS-CoV-2抗体假阳性率分别为9.5%(8/84)～84.6%(11/13)接近，表明RF是SARS-CoV-2抗体检测最主要的干扰因素，其次为CH50和F.antibody，再次为lysozyme，另有1例未检出上述干扰物质，说明还有其他因素干扰SARS-CoV-2抗体检测而出现假阳性。1例孕妇同时检测出SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体呈假阳性，血清AFP阳性，同时CH50升高，本研究中其他SARS-CoV-2抗体假阳性样本均未检测出AFP、CEA升高，提示该孕妇(妊娠38周)可能为免疫系统功能活跃，补体升高而导致SARS-CoV-2抗体检测呈假阳性。在本研究中不同假阳性因素浓度高低与引起抗体检测结果的变化没有发现统计学的差异，可能是不同假阳性因素的例数较少有关。

在SARS-CoV-2抗体检测应用评价中，对可疑阳性结果进行间隔一定时间多次(2次以上)检测，依据抗体产生规律分析动态检测结果的变化来鉴别单次IgM和IgG抗体检测阳性结果的真假，从而避免假阳性结果对临床诊断的误导[13-14]，同时还要关注不同种冠状病毒N蛋白或S蛋白存在免疫交叉反应等因素干扰[15-17]。

综上所述，SARS-CoV-2特异性IgM和IgG抗体检测作为COVID-19核酸检测的有益补充，为SARS-CoV-2感染患者的诊断和治疗提供有力支持。但应采取适宜的复查和诊疗路径以排除外源性干扰、检测试剂的抗干扰能力和内源性干扰等因素所致的假阳性结果。

利益相关声明：论文所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献说明：何巍巍论文撰写；胡志坚对研究的思路及设计有关联贡献；周会祥、王文娟、袁育珺、罗彦妮、黄龙、段训新、黄会金、胡修全、代龙文、徐肖丁、王波兰、陈春辉、欧阳盛武、喻文、赵德刚、花蕾、李建根、刘峰、余晓慧、李年德、刘文仲、高明祥、谌秋华、赵咏梅、冷文学、何创华、郭淼生参与研究数据的获取等过程。