免疫组化与PCR检测梅毒患者皮损组织蜡块中梅毒螺旋体的敏感性评价

付 钰，杨 羚，刘栋华

（1.广西医科大学第一附属医院，广西 南宁 530021；2.广西医科大学第一临床医学院，广西 南宁 530021；3.广西艾滋病防治研究重点实验室，广西 南宁 530021）

近年来，随着人们生活方式逐渐多元化、思想的开放化以及人口流动性增大，我国的梅毒发病率呈上升趋势。梅毒螺旋体（Treponema pallidum，TP）是一种“拒绝”体外培养的病原体［1］，因此，相对其他可体外培养、增殖的传染病病原体来说，关于TP的研究受到了很大限制，且由于其体积小、重量轻、不易着色，临床对梅毒的病原学检测存在一定的局限性。目前，暗视野显微镜观察和镀银染色为常用的TP病原学检测方式，而免疫组织化学法（Immunohistochemistry，IHC）和聚合酶链反应法（Polymerase chain reaction，PCR）是较为特异的检测方式。IHC是通过抗原抗体相结合的原理呈现出皮损组织中TP的分布情况，并加以苏木素复染来表现组织细胞的形态，而PCR则是在分子水平上检测样品中TP的基因片段，间接性反映TP的存在，既往采用PCR检测TP的研究大多针对早期梅毒患者的血液和皮损组织或分泌物样本［2，3］，如今该方法已经成为一种成熟的检测方式。

二期梅毒患者的皮损通常缺乏特异性且呈多样化，可出现红斑、丘疹、斑丘疹、斑块、结节、脓疱或者溃疡等，因此从皮损的形态容易误诊为其他皮肤性疾病。另外，包括快速血浆反应素环状卡片试验（rapid plasma reagin test，RPR）、性病研究实验 室 试 验（venereal disease research laboratory test，VDRL）、苯甲胺红不加热血清试验（toluidine red unheated serum test，TRUST）在内的梅毒血清学试验敏感性高而特异性低，尽管梅毒螺旋体颗粒凝聚试验（treponema pallidum particle agglutination test，TPPA）为TP特异性诊断，但以上检测方式均容易在二期梅毒中出现前带现象，导致检测结果假阴性，同时，其假阳性也常见于自身免疫性疾病、麻风患者，海洛因成瘾者，少数孕妇或老人中［4］。因此，当患者出现多形性皮损，高度怀疑梅毒却出现诊断困难时，可取患者的皮损组织进行IHC或PCR帮助临床医师进一步确诊。为了探讨两种方法检测TP的敏感性，本次研究均选择梅毒患者皮损组织蜡块作为检测样本，分别使用IHC和PCR方法进行检测。

1 资料与方法

1.1 样品来源 选取广西医科大学第一附属医院皮肤科26名诊断为梅毒的患者的皮损病理活检组织（包括早期梅毒患者的硬下疳、二期梅毒疹和其他类型的皮损），其中8名患者合并有人类免疫缺陷病毒（human acquired immunodeficiency virus，HIV） 感染，所有组织均进行福尔马林浸泡固定后用石蜡包埋，以组织蜡块的形式进行保存和运输（表1）。

表1 患者一般特征和实验结果

1.2 研究方法

1.2.1 IHC过程 ① 将患者皮损的组织蜡块切成3um的薄片，贴附于载玻片上；② 烘烤切片0.5h后用环保脱蜡液进行梯度脱蜡，再用递减浓度的乙醇溶液（100%，95%，85%，75%）进行梯度水化；③ 高温水浴的环境下用pH 8.0的EDTA修复样本抗原；④ 滴加正常山羊血清于切片上孵育30min进行抗原封闭；⑤ 用纸吸干正常山羊血清，将梅毒螺旋体抗体工作液（中杉金桥，中国）均匀地滴在组织上，尽量使抗体工作液布满整个组织，37℃孵育4h或室温孵育过夜；⑥ 清洗一抗5min×3次，将山羊抗兔抗体原液（Abcam，英国）进行适当比例稀释后滴加在切片上，于室温或37℃孵育30min；⑦ 清洗二抗5min×3次后用纸吸干玻片上多余的水分；⑧ 滴加DAB显色溶液（中杉金桥，中国）进行切片显色；⑨ 温水终止显色，用苏木素染液复染组织细胞核20s后用盐酸酒精分化、温水反蓝；⑩ 用纸吸干切片多余水分，自然风干；滴加透明护甲油封片，光镜下观察切片。

1.2.2 DNA提取 ① 将每个皮损组织蜡块切成5um的薄片，收集包裹完整组织的切片（10～15）片（视组织大小适当增减切片数量），放入1.5ml的微型离心管中；② 离心管中加入适量二甲苯，涡轮振荡15s，使样品充分脱蜡后暴露出组织；③ 室温下离心样品（13000 rpm）3 min，弃掉上清液；④ 向沉淀中加入无水乙醇，将混合物再次充分振荡15s后离心（13000rpm）2min；⑤ 弃掉上清液，打开微型离心管盖子，放置室温直至乙醇完全挥发。⑥ 使用 QIAamp DNA FFPF TISSUE试剂盒（QIAGEN，德国）进行组织的DNA提取：① 将180uL ALT溶液和20uL蛋白酶K加入沉淀中充分震荡15s后将样品置于56℃水浴过夜直至样品完全裂解；② 次日，将水温升至90℃后继续水浴1h（此步骤用于修复组织福尔马林固定期间发生的部分核酸修饰）；③ 水浴后取出离心管，快速离心，加入200μl Al溶液和200μl无水乙醇；④ 将混合物转至核酸吸附柱中，离心（8000rpm）1min，弃掉洗脱液（吸附柱不用更换）；⑤ 加入500μl AW1溶液至吸附柱，离心（6000rpm）min，弃掉洗脱液（吸附柱不用更换）；⑥ 加入500μl AW2溶液至吸附柱，离心（14000rpm）3min，弃掉洗脱液（吸附柱不用更换）；⑦ 加入120uL AE溶液，室温孵育1～5min，离心（6000rpm）1min，留取洗脱液，洗脱液内则包含组织的全部DNA。⑧ 检测洗脱液中核酸纯度与浓度（Thermofisher NanoDrop，USA）。

1.2.3 TP基因鉴定 选择Tp47基因和poIA 基因分别对组织中的TP进行检测。采用巢式PCR对Tp47基因片段进行扩增，以Tp47K-1 （5′-GTTGAGTATTGGGCCGAAA-3′）和Tp47K-2（5′-ATACCGTTCGCAATCAAAG-3′）作为其外引物，用K03A（5′-GAAGTTTGTCCCAGTTGCGGTT-3′）和K04（5′-CAGCCATCAGCCCTTTTCA-3′）作为其内引物，最终扩增得到大小为261bp的基因片段［6］。采用普通PCR方式对poIA基因进行扩增，以poIA-1（5′-TGCGCGTGTGCGAATGGTGTGGTC-3′）为 上游 引 物，poIA-2（5′-CACAGTGCTCAAAAACGCCT GCACG-3′）为下游引物，最终获得大小为378bp的基因片段［7］。PCR反应体系中包含25uL 2×Santaq PCR Mix（上海生工生物，中国）、X uL DNA模板（X为DNA模板体积量，测量并计算维持核酸浓度在1～10 ng/μl之间）、上下游引物各2uL，最后用dd H20补充至50uL。 PCR 的热循环（SimpliAmp PCR仪，ABI，USA）过程如下：预变性94℃ 5min；变性94℃ 30s，退火55℃ 30s，延伸72℃ 40s，变性至延伸一共持续35个循环；终延伸72℃ 10min；PCR产物保存于4℃。使用3%琼脂糖凝胶（索莱宝生物，中国）电泳进行PCR产物纯化，Marker 选用50bp DNA Ladder（天根生物，中国），通过紫外线凝胶成像仪（Syngene G：BOX，英国）显像。

2 结果

一共26例样本均为IHC阳性，阳性率为100%。可见TP沿着表皮中、下部分及血管上皮周围分布（图1）。7例样本显示Tp47-PCR阳性，9例样本显示poIA-PCR阳性（图2），阳性率分别为27%和35%，同时，poIA-PCR阳性样本包括了Tp47-PCR阳性样本。

图 1 IHC 结果图

图 2 TP-PCR 结果

（1a：TP沿表皮中、下部分布（IHC×200）；b：TP浸润血管上皮及其周围（IHC×400））。

3 讨论

梅毒螺旋体PCR （TP-PCR）检测现已被推荐为诊断一期或二期梅毒的有效手段［5］，TP的感染与否可以在基因水平上得到证实，为梅毒的诊断提供病原学证据。Tp47基因编码一种参与TP细胞壁合成的细胞质膜蛋白（47KDa）［5，6］，是最常用的TP-PCR检测的靶基因。本研究采用巢式PCR扩增Tp47基因片段的优势在于：一方面，普通PCR检测中目标DNA片段数量较少时普通PCR灵敏度低、不稳定、重复性差，而巢式PCR则可以通过二次扩增提高其检测敏感度［8］；另一方面，第二次扩增的片段是第一次扩增片段的一部分，提高了检测的特异度。

poIA 编码DNA聚合酶I，参与DNA的修复，尽管poIA 基因在大多数细菌的生理过程中参与其遗传物质的复制，但在TP的基因表达中表现出很强的特异性［9］。在 Gayet-Ageron 等人的研究中，比较了Tp47-TP-PCR 与 poIA-TP-PCR 在相同临床标本上的检测［10］，发现两者敏感度性几乎完全一致，甚至可以相互替代检测，因此，本研究选择在检测Tp47基因同时，同时检测poIA基因作为对比。从实验结果可看出，两个靶基因的的阳性率也极为接近。

本研究的实验结果表明，IHC检测梅毒患者皮损组织蜡块中TP的阳性率明显高于PCR（表1）。在 Hoang 等人的研究中，比较了17例二期梅毒患者19例皮损组织样本蜡块中的IHC和银染色结果，显示IHC检测敏感度为71%，优于银染色的41%（p=0.084）［11］；在 Buffet等人的研究中，将12例二期梅毒患者的皮损活检组织蜡块分别进行IHC（91%）与基于TP47基因的PCR检测，结果显示IHC（91%）检测敏感度优于PCR检测（75%）［12］；Behrhof等人的研究中，20例二期梅毒患者皮损组织蜡块标本通过免疫组化、银染色或和PCR检测，免疫组化检测17/35（48.6%）例阳性，银染色9/35（25.7%）例阳性，PCR检测14/36（38.9%）例阳性［13］。可见无论是相较于银染或PCR，IHC对梅毒患者皮损组织蜡块的检测敏感性均较高。

在既往的报道中，Cuini Wang等人运用PCR检测262例不同分期梅毒患者（84例一期梅毒、97例二期梅毒和81例潜伏梅毒）的全血TP-DNA，结果显示，初期与二期梅毒患者的DNA检测阳性率分别为53.6%和62.9%，远高于潜伏梅毒患者（7.4%）（p＜ 0.001）［2］；Palmer等人对梅毒患者肛门-生殖器或口腔溃疡拭子新鲜标本进行PCR检测，结果显示在一期梅毒的检测中，PCR的敏感度为94.7%，特异度为98.6%，阳性预测值为94.7%，阴性预测值为98.6%；二期梅毒的灵敏度为80%，特异性为98.6%，阳性预测值为88.9%，阴性预测值为97.2%［3］。由此得知，PCR在检测非蜡块的样本敏感度相对蜡块样本高。

对于本研究中PCR检测组织蜡块敏感性较低的原因，我们认为可能为以下几点原因：① 福尔马林容易在空气中氧化成为甲酸，甲酸对于DNA有很强的降解作用，因此使用陈旧的福尔马林溶液固定组织或固定时间过长都会使样本中的DNA降解，从而使得扩增效率降低；② 组织固定后，核酸蛋白广泛地交联，使DNA与蛋白质形成牢固的复合物，DNA容易断裂成为不完整的片段，导致DNA不容易被提取；③ 在福尔马林固定过程中，嘌呤基、碱基与组蛋白之间形成了以多聚甲醛为介体的甲基桥，导致DNA的交联，在石蜡包埋过程中随机降解［14］；④ 尽管在从标本中提取DNA的过程中，采用高温水浴尽可能减少福尔马林溶液对抗原的交联抑制。但由于每块组织的大小不均匀，选择的切片数量也不相同，人为因素会导致裂解和修复过程不完全；⑤ 操作过程中样本量的损失；⑥ 样本中的病原体载量小。

本研究的结果表明，IHC对于梅毒患者皮损组织蜡块样本来说，是一种特异性与敏感性都很高的病原体检测方法，显色后可在光镜下清楚观察到皮损中TP的分布。但是，IHC具有检测样本的局限性，对于血液、唾液、分泌物样本，即便可风干固定于玻片之上，仍不能避免样本在IHC过程中反复被清洗而导致的损耗。另一方面，这些样本的内容物多样，若涂片不均，则会导致视野背景杂乱，影响阅片质量。PCR检测可以避免上诉非组织蜡块样本造成的影响，因此对于无皮疹的梅毒患者的血液、唾液、分泌物样本，PCR不失为一种敏感度和特异度相对较高的检测辅助性检测。

综上所述，IHC对梅毒患者皮损组织蜡块中TP的检测敏感性高于PCR，对于临床出现多样化皮疹损，高度怀疑梅毒的患者却出现诊断困难时，IHC可作为一种针对皮损组织蜡块的准确、敏感的特异性检测方式，帮助临床诊断。