苹果去皮发酵对苹果树莓复合果酒理化成分的影响研究

曾朝珍，康三江，慕钰文

(甘肃省农业科学院农产品贮藏加工研究所，甘肃兰州 730070)

果酒是一种高附加值的水果产品，它含有重要的营养成分，如矿物质、抗氧化物以及所用水果的芳香气味。果酒的生产已经成为水果加工业的一个组成部分，如今，市场上有各种形状、颜色、味道和营养价值的水果，许多水果被广泛用于生产发酵饮料。世界各地用于生产果酒的水果除了葡萄外还包括苹果、树莓、樱桃、野生杏、梨、猕猴桃等。随着消费水平的提高，口感佳、营养高和风味好的果酒更受消费者青睐。通过使用苹果、树莓、猕猴桃、火龙果、菠萝、枣等水果生产复合果酒，不仅可以克服单一果酒存在酒体单薄、营养成分不丰富的缺陷，而且也改善了果酒的理化成分和感官特性。

果皮的主要成分是果胶，是一类以聚半乳糖醛酸为主、结构复杂的多糖聚合物。在水果发酵过程中果胶酶可对果胶质进行分解产生果胶酸和甲醇。甲醇是果酒酿造中产生的对果酒品质不利的代谢产物。因此，需要严格控制甲醇在果酒发酵过程中的含量。去皮发酵可以降低发酵原料中果胶的含量，从而降低甲醇的含量，但是去皮发酵对于复合果酒其他理化成分影响的研究较少。基于此，本试验以苹果和树莓为原料，研究苹果去皮发酵对复合果酒理化特性的影响，以期为苹果树莓复合果酒高值化深加工提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

原料：富士苹果，购于甘肃省庆阳市；红树莓，购于甘肃省临夏州和政县；酿酒酵母32168，中国工业微生物菌种保藏管理中心；果胶酶，宁夏和氏璧生物技术有限公司。

试剂及耗材：苹果酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸（均为色谱纯），美国Sigma 公司；天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸（均为色谱纯），上海安谱实验科技股份有限公司；总酚、黄酮测定试剂盒，苏州科铭生物技术有限公司。

仪器设备：LRH-150 型生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；ZHJH-C11128 型超净台，上海智城分析仪器制造有限公司；YXQ-70A 型立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅医疗器械厂；SpectraMax 190 型酶标仪，Molecular Devices 公司；RIGOL L-3000 型高效液相色谱仪，苏州普源精电科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 酵母菌种活化

参照曾朝珍等的方法将酿酒酵母32168 进行活化，活化后于4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 苹果酒酿造工艺

参照曾朝珍等的接种方式及发酵工艺，将树莓和苹果（去皮和不去皮）按原料比为30∶100 的条件制备苹果树莓复合果汁，于28 ℃下厌氧静置发酵直至发酵结束。

1.2.3 测定方法

（1）还原糖、有机酸、总酸的测定：参照GB/T 15038—2006的方法测定。

（2）可溶性固形物、pH 值测定：采用糖度计、pH计进行测定。

（3）总酚、黄酮的测定：采用试剂盒法，参照苏州科铭生物技术有限公司试剂盒说明书的操作方法进行测定。

（4）游离氨基酸的测定：参照饶静等的方法并作修改。

氨基酸的提取：取样本清液200 μL 以及氨基酸标准品溶液200 μL，分别置于1.5 mL EP管中；往每个离心管中准确加入正亮氨酸内标溶液20 μL；分别加入三乙胺乙腈溶液200 μL（确保pH＞7），异硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，混匀后25 ℃下放置1 h。然后加入正己烷400 μL 至离心管，摇晃后放置10 min；取下层溶液，0.45 μm针式过滤器过滤。

HPLC 液相条件：Kromasil C反相色谱柱（250 mm*4.6 mm，5 μm），进样量10 μL，流速1.0 mL/min，柱温40 ℃，走样时间为45 min。流动相A：称取7.6 g 无水乙酸钠，加水925 mL，溶解后用冰醋酸调节pH6.5，然后加入乙腈70 mL，混匀，用0.45 μm滤膜过滤；流动相B：80%乙腈水溶液。

1.2.4 数据处理

试验数据采用Excel 2003 进行汇总处理，数据以“平均值±标准差”表示。采用DPS 7.05进行显著性差异分析（p＜0.05），采用origin 2019软件对实验数据进行作图分析。

2 结果与分析

2.1 苹果树莓复合果酒基础理化成分分析

表1 为树莓和苹果（去皮和不去皮）混合后未发酵复合果汁与发酵后复合果酒的基本理化指标。由表1 结果可看出，在未发酵复合果汁中，除了可溶性固形物、总酸以外，树莓与不去皮苹果混合后的果汁中果糖、葡萄糖、蔗糖、pH 值、总酚、总黄酮含量比树莓与去皮苹果混合后的果汁含量高且各理化成分之间存在着显著差异性（p＜0.05）；树莓与不去皮苹果复合果汁发酵时间较树莓与去皮苹果混合发酵少1 d，且最终果糖、葡萄糖、蔗糖含量之间差异不显著（p ＞0.05），而其他发酵后的指标还是苹果不去皮复合发酵高于苹果去皮复合发酵且存在显著差异性（p＜0.05）。同一地理来源样品的不同部位(果皮和果肉)的理化特性存在显著差异，果皮中的碳水化合物、脂肪、灰分、抗坏血酸、还原糖和总可溶性固形物含量较高，去皮使未发酵复合果汁中还原糖、可溶性固形物、pH 值都降低。苹果不同部位的酚类化合物组成也不同，与果肉相比，苹果皮中的酚类化合物含量更高，不去皮复合果汁酚类物质含量高于去皮复合果汁。发酵后除了总酸增加以外，其他指标与未发酵果汁相比都降低，且带皮发酵果酒中的含量高于去皮发酵果酒。

表1 树莓苹果(去皮和不去皮)复合果汁与果酒基本理化指标

2.2 苹果树莓复合果酒游离氨基酸分析

树莓和苹果（去皮和不去皮）复合后未发酵与发酵后17 种氨基酸含量的分析结果见表2、图1 所示，其不同处理之间氨基酸含量存在显著差异性（p＜0.05）。

表2 树莓和苹果(去皮和不去皮)复合果汁与果酒氨基酸含量 (μg/mL)

图1 树莓和苹果（去皮和不去皮）复合果汁与果酒氨基酸含量聚类热图

表2 结果表明，在未发酵复合果汁中，除了蛋氨酸、赖氨酸以外，树莓与不去皮苹果复合果汁（FH-B-0）中的氨基酸含量比树莓与去皮苹果复合果汁（FH-Q-0）中的含量高且成分之间存在着显著差异性（p＜0.05）；而经过发酵以后，除了异亮氨酸以外，树莓和去皮苹果发酵酒（FH-Q-10）与树莓和不皮苹果发酵酒（FH-Q-9）中的氨基酸含量较复合后未发酵的氨基酸含量都显著降低且不同处理发酵酒之间氨基酸含量差异不显著（p＞0.05），而胱氨酸在不同处理发酵酒中均未检出，发酵前后大多数游离氨基酸含量差异显著。根据图1 氨基酸含量聚类分析结果可以看出，树莓和苹果（去皮和不去皮）复合发酵酒成为一类，而树莓与去皮苹果复合果汁和树莓与不皮苹果复合果汁各自成为一类，此结果说明去皮对果汁中氨基酸含量影响较大，而发酵以后其影响不显著（p＞0.05）。去皮对复合果汁中大部分氨基酸含量造成了显著差异，但发酵后大多数游离氨基酸含量差异不显著（p＞0.05），说明复合果酒中的氨基酸组成结构取决于发酵过程。苹果酒中的氨基酸除了来源于果汁中的蛋白质酶解，还来自于酵母发酵过程中的代谢产物和发酵完毕后酵母细胞的自溶。KATO 等研究发现，葡萄酒中的氨基酸在发酵前后也变化显著，此研究结果也只支持本研究中氨基酸含量变化的结果。

2.3 苹果树莓复合果酒有机酸分析

树莓和苹果（去皮和不去皮）复合果汁和果酒中苹果酸、乳酸、柠檬酸及琥珀酸的分析结果如表3、图2、图3 及图4 所示，其不同处理之间有机酸含量存在显著差异性（p＜0.05）。

表3 树莓和苹果(去皮和不去皮)复合果汁与果酒有机酸含量

图2 树莓和苹果（去皮和不去皮）复合果汁与果酒有机酸含量变化

图3 树莓和苹果（去皮和不去皮）复合果汁与果酒有机酸含量PCA图

图4 树莓和苹果（去皮和不去皮）复合果汁与果酒有机酸含量聚类热图

由表3 与图2 分析结果可以看出，在未发酵复合果汁中，树莓与不去皮苹果复合果汁（FH-B-0）中的苹果酸、柠檬酸含量比树莓与去皮苹果复合果汁（FH-Q-0）中的含量高，乳酸则是在树莓与去皮苹果复合果汁（FH-Q-0）中较高，并且各成分之间存在着显著差异性（p＜0.05），琥珀酸虽然在树莓与不去皮苹果复合果汁（FH-B-0）中较高，但是与树莓和去皮苹果复合果汁（FH-Q-0）中的含量无显著性差异（p＞0.05）；而经过发酵以后，树莓和去皮苹果发酵酒（FH-Q-10）与树莓和不去皮苹果发酵酒（FH-B-9）中的乳酸和琥珀酸含量较复合果汁的含量都显著增加且不同处理发酵酒之间含量差异显著（p＜0.05），而苹果酸和柠檬酸经发酵后含量较复合果汁都显著降低且不同处理发酵酒之间含量差异显著（p＜0.05）。根据图4 有机酸含量主成分分析结果可以看出，树莓与不去皮苹果复合后的果汁（FH-B-0）中苹果酸和柠檬酸含量最高，树莓和不去皮苹果发酵酒（FH-B-9）中琥珀酸含量最高，树莓和去皮苹果发酵酒（FH-Q-10）中乳酸含量最高；根据图5 有机酸含量聚类分析结果可以看出，树莓和苹果（去皮和不去皮）复合果汁、发酵酒各自成为一类。除了乳酸以外，去果皮会使其他有机酸含量降低，而发酵使苹果酸和柠檬酸的含量降低，而使乳酸和琥珀酸含量增加，此结果说明去皮及发酵都对有机酸含量有影响。苹果酒中的有机酸类化合物除了一部分来源于苹果汁之外，还可以在发酵过程中产生。去皮使果汁和复合果酒中的有机酸都降低，而发酵使苹果酸含量降低，是因为其被转化成其他化合物所致，柠檬酸在发酵过程中的变化趋势与苹果酸相似。琥珀酸和乳酸是酵母在发酵过程中常见的代谢产物，也是苹果酒中重要的有机酸类化合物，乳酸的酸味柔和，有利于提升苹果酒的口感。

3 结论

本研究以树莓和苹果（去皮和不去皮）复合进行发酵，对复合果汁以及果酒测定相关的基本理化指标，通过测定各类物质的含量变化并结合聚类分析及主成分的分析方法，研究了苹果去皮发酵对复合果酒理化特性的影响。结果表明：还原糖、可溶性固形物、pH 值及酚类物质含量在去皮未发酵复合果汁中都降低；发酵后除了总酸增加以外，其他指标与未发酵果汁相比都降低，且带皮发酵果酒中的含量高于去皮发酵果酒。氨基酸除了蛋氨酸、赖氨酸以外，去皮复合果汁中其余氨基酸含量都低于未去皮复合果汁，而发酵以后去皮造成的氨基酸含量差异不显著；有机酸中除了乳酸以外，去果皮会使其他有机酸含量降低，而发酵使苹果酸和柠檬酸的含量降低，而使乳酸和琥珀酸含量增加。