温肾养肝汤对MPTP所致帕金森病多巴胺能神经元损伤保护的分子机制研究

徐成成,陆艳,唐莉莉,梁艳,赵杨

(南京市中医院脑病科,南京中医药大学附属南京中医院，江苏 南京 210001)

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一种常见的神经系统退行性疾病,以中脑黑质多巴胺(Dopamine,DA)能神经元丧失,纹状体中DA含量明显减少以及黑质和蓝斑中存在路易小体(Lewy body,LB)等为主要病理特征,以肌张力增强、运动障碍,同时可能伴有认知能力下降为主要临床症状[1]。据估计,到2030年,我国PD患者将会达到494万,约占全世界患者50%[2]。目前,临床上只能通过外科手术以及左旋多巴类、左旋多巴增效剂、DA受体激动剂和促DA释放类等药物干预来控制PD病情,尚无法根治,且药物短期疗效较好,但长期使用易出现疗效减退现象,寻找更为有效的治疗PD新药尤为迫切[3]。

PD致病因素较多,发病机制尚不明确,诸多证据表明黑质内DA能神经元退化与线粒体功能障碍和自噬通路功能异常等相关[4],以ROS产生过多、ATP产生减少、线粒体DNA损伤等为主要特征的线粒体功能缺陷在PD发病过程中起着关键作用[5]。同时,线粒体自噬通路的异常,不能及时清除损伤或病变的线粒体,导致线粒体动态性失调,造成PD的发生和发展[6]。

温肾养肝汤是江苏省名中医赵杨教授治疗PD的经验方,全方由肉苁蓉、乌药、益智仁、淮山药、炒白芍和钩藤6味药组成,临床上具有保护DA能神经元,延缓PD的疗效[7]。前期研究结果也证实,方中君药肉苁蓉能明显升高黑质纹状体中DA及其代谢物含量,下调α-突触核蛋白表达,保护PD模型大鼠的DA能神经元,改善大鼠神经行为学特征[8],但全方治疗PD的作用机制尚不清楚。本研究建立1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)致PD小鼠模型,观察温肾养肝汤保护DA能神经元的作用,并从线粒体功能及自噬通路方面探究其分子机制,以期为PD治疗药物开发提供更多科学依据。

1 材料

1.1 实验动物

成年雄性C57/BL6小鼠50只,10周龄,体质量25～30 g,由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供,动物生产许可证号:SCXK(沪)2018-0006。在南京中医药大学动物实验中心适应性饲养(伦理号:202102A002),自由饮水,温度20～25 ℃,湿度40%～70%。适应性饲养1周。

1.2 药材

1.2.1 温肾养肝汤处方 肉苁蓉30 g,乌药20 g,益智仁30 g,淮山药20 g,炒白芍20 g,钩藤20 g,按处方量加20倍纯水,煎煮2次,每次1.5 h,浓缩至生药量4 g·mL-1。给药前，分别稀释成高、低剂量1.6、0.8 g·mL-1

1.2.2 试剂 MPTP(货号:M0896，用无菌生理盐水配制成3 mg·mL-1溶液)和酪氨酸羟化酶(Tyroxine hydroxylase,TH)多克隆抗体(货号:SAB4200697)购自Sigma-Aldrich公司;金刚烷胺(货号:A800770，配置成4 mg·mL-1溶液)购自上海麦克林;ATP酶(ATPase)活性检测试剂盒(货号:ab234055)和线粒体呼吸链复合物Ⅰ(Complex Ⅰ)活性检测试剂盒(货号:ab109721)购自Abcam公司;PINK1抗体(货号:ab23707)、Parkin抗体(货号:ab264105)、VDAC1抗体(货号:ab15895)、P62抗体(货号:ab56416)、LC3 Ⅱ/Ⅰ抗体(货号:ab128025)、COX Ⅳ抗体(货号:ab202554)、山羊抗小鼠二抗(货号:ab205719)和山羊抗兔二抗(货号:ab205718)均购自Abcam公司;Tubulin抗体(货号：AF7011)购自Affinity公司；ECL试剂盒(货号：P1000-25)购自北京普利莱生物技术公司,二氨基联苯胺(DAB)(货号：ZLI-9017)购自中杉金桥;线粒体提取试剂盒(货号:SM0020)购自北京索莱宝;DA(货号:B25300)、高香草酸(Homovanillic acid,HVA)(货号:B20433)、3,4-二羟基苯乙酸(3,4-Dihydroxyphenylacetic acid,DOPAC)(货号:B21788)购于上海源叶生物。

2 方法

2.1 动物饲养分组

50只小鼠分笼后,随机分成正常组、模型组、温肾养肝汤低剂量组(低剂量组)、温肾养肝汤高剂量组(高剂量组)、金刚烷胺组,每组10只。

2.2 动物造模

适应性饲养1周后,除正常组外,其余组小鼠每日腹腔注射30 mg·kg-1MPTP,每周2次,连续4周。

2.3 药物处理

根据动物体表面积折算小鼠给药量[9]。造模1周后,温肾养肝汤低剂量组和高剂量组小鼠分别灌胃8、16 g·kg-1·d-1;金刚烷胺组小鼠灌胃40 mg·kg-1·d-1,正常组和模型组小鼠灌胃等体积纯水,每日1次,连续3周。最后1次MPTP腹腔注射后,进行行为学检测。

2.4 行为学检测

从最后一次MPTP注射前5 d开始,每天对小鼠进行训练以适应行为学检测,采用爬杆试验、牵引试验和滚筒试验[10]检测5组小鼠肢体运动协调性。

爬杆试验:在垂直木制表面粗糙的杆(高50 cm,直径1 cm)顶部固定一个直径为2.5 cm的塑料小球,将小鼠放置于杆顶,记录小鼠下降转弯潜伏期和整个爬杆时间，测定3次,每次间隔30 min。

牵拉试验:将小鼠前肢悬挂在水平钢丝上,用两个后肢抓住钢丝记3分,用单个后肢抓住钢丝记2分,两个后肢均抓不住钢丝记1分,落下得0分。

滚筒试验:小鼠在滚轴上(直径6 cm,转速20 r·min-1)保持平衡并连续运动,记录运动时间,连续测20次,取平均值。

2.5 脑组织取材

行为学检测后,腹腔注射45 mg·kg-1戊巴比妥钠麻醉,将小鼠大脑剥离,切割成2个完全相同的半球,1个半球分离黑质,部分黑质4%甲醛固定,用于组织病理学研究;另1个半球分离黑质和纹状体,-80 ℃储存。

2.6 免疫组化法分析DA能神经元数[11]

分别取黑质组织,石蜡包埋后,切成30 μm厚,PBS洗涤后,牛血清白蛋白封闭,加TH抗体(1∶1 000)4 ℃孵育过夜,洗涤后,再加生物素标记的二抗,室温孵育,经DAB显色后封片,取21个连续切片选择视野于同一放大倍数、同一光强度下拍摄,用无偏体视学方法计算黑质总TH阳性神经元数量。

2.7 尼氏染色

冷冻切片依次经过二甲苯、无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇和蒸馏水处理,切片在尼氏染色液中40 ℃孵育10 min,并用蒸馏水清洗。之后,切片依次经70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇,各脱水2 min;然后经无水乙醇2次,每次5 min,二甲苯2次,每次10 min。最后DPX封片,显微镜下尼氏体呈紫色，细胞核呈淡紫色。

2.8 纹状体中DA及其代谢物检测

组织匀浆后,取50 μL上清液,按照文献描述的方法[12],测定DA、HVA和DOPAC含量。HPLC色谱条件:电化学检测器(美国Waters公司,2696),流动相为A(1%醋酸铵水溶液)∶B(甲醇)=94∶6等度洗脱,流速为0.5 mL·min-1,柱温22 ℃。用外标法计算DA及其代谢物HVA、DOPAC的含量。

2.9 线粒体酶活性评价

按照试剂盒说明书检测ATPase和ComplexⅠ的活性。

2.10 Western blot检测

取黑质组织匀浆,加RIPA裂解缓冲液,用试剂盒提取线粒体总蛋白,再用BCA法测定蛋白浓度。上样量50 μg,根据目的蛋白分子量选择10%～12% SDS-PAGE进行电泳分离,转膜后,按比例孵育一抗[PINK1抗体(1∶1 000)、Parkin抗体(1∶1 000)、VDAC1抗体(1∶1 000)、P62抗体(1∶1 000)、LC3 Ⅱ/Ⅰ抗体(1∶1 000)],洗涤后,加二抗孵育,ECL显影,以Tubulin(1∶3 000)为总蛋白内参、COX Ⅳ(1∶1 000)为线粒体蛋白内参,计算目的蛋白的相对表达水平,所有试验重复3次。

2.11 统计学方法

3 结果

3.1 小鼠造模情况

模型组小鼠腹腔注射MPTP后出现全身震颤、运动迟缓、活动减少、后肢张开以及皮毛和尾巴竖立的特征,而且随着MPTP给药次数的增加,上述症状趋于明显,提示造模成功。

3.2 温肾养肝汤对PD小鼠行为学的影响

与正常组相比,模型组小鼠爬杆完成时间明显延长(P<0.01),滚筒试验时间明显缩短(P<0.01),牵拉试验得分显著降低(P<0.01),经温肾养肝汤干预后,高剂量组小鼠爬杆完成时间和滚筒试验时间以及牵拉试验得分均得到明显改善,与模型组比较具有统计学差异(P<0.01),提示温肾养肝汤可以改善PD小鼠运动障碍,增强肌肉抓力。见图1。

3.3 温肾养肝汤对PD小鼠中脑黑质DA能神经元数的影响

免疫组化结果显示,正常组小鼠DA能神经元胞浆和纤维染色较深,细胞突起明显,TH免疫反应阳性信号明显;MPTP可引起小鼠明显的DA能神经元毒性,中脑腹侧被盖区(Ventral tegmental area,VTA)和黑质致密部(SNpc) DA能神经元明显丢失,TH免疫反应阳性细胞数减少,多数细胞无突起,而经温肾养肝汤干预后,高剂量组可见大量TH免疫反应阳性细胞,细胞突起较易观察(P<0.01)。尼氏染色结果显示,相比于正常组,模型组尼氏小体缺失严重(P<0.01)，经温肾养肝汤干预后,尼氏小体数明显增加(P<0.01)。见图2。

注：与正常组比较,**P<0.01;与模型组比较,图1 温肾养肝汤对PD小鼠运动障碍的影响Fig. 1 Effects of Wenshen Yanggan Decoction on dyskinesia in PD mice

注：与正常组比较,**P<0.01;与模型组比较,图2 温肾养肝汤对PD小鼠DA能神经元的影响Fig. 2 Effects of Wenshen Yanggan Decoction on dopaminergic neurons in PD mice

3.4 温肾养肝汤对PD小鼠大脑纹状体DA能神经元功能的影响

结果见表1和图3。与正常组相比,模型组小鼠纹状体中DA、DOPAC和HVA含量明显降低(P<0.01),DOPAC/DA和HVA/DA明显升高(P<0.01),而给予高剂量温肾养肝汤可明显提高DA及其代谢物HVA含量(P<0.05，P<0.01),DOPAC/DA和HVA/DA也有不同程度降低(P<0.05，P<0.01),阳性对照药金刚烷胺也能明显减轻MPTP致PD小鼠纹状体DA的损失(P<0.01),提示温肾养肝汤或金刚烷胺能改善DA的利用率和周转代谢率。

表1 温肾养肝汤对PD小鼠纹状体DA及其代谢物的影响Table 1 Effects of Wenshen Yanggan Decoction on DAand its metabolites in PD mice

注：与正常组比较,**P<0.01;与模型组比较,图3 温肾养肝汤对PD小鼠纹状体DOPAC/DA和HVA/DA的影响Fig. 3 Effects of Wenshen Yanggan Decoction on DOPAC/DA and HVA/DA in PD mice

3.5 温肾养肝汤对PD小鼠线粒体酶活性的影响

结果见图4。与正常组相比,模型组小鼠线粒体酶活性明显低于正常小鼠(P<0.01),温肾养肝汤高剂量能明显提高ATPase和ComplexⅠ酶活性(P<0.01),提示温肾养肝汤能明显改善PD小鼠黑质线粒体酶活性,恢复线粒体功能,为神经元的存活供能。

注：与正常组比较,**P<0.01;与模型组比较,图4 温肾养肝汤对PD小鼠线粒体酶活性的影响Fig. 4 Effects of Wenshen Yanggan Decoction on ATPase and ComplexⅠ activities in PD mice

3.6 温肾养肝汤对线粒体自噬通路蛋白表达的影响

Western blot结果显示,造模后小鼠黑质线粒体的PINK1、Parkin、VDAC1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达明显下调(P<0.01),P62明显上调(P<0.01),高剂量温肾养肝汤干预可显著改善各蛋白表达(P<0.01),提示温肾养肝汤对DA能神经元保护作用可能与调控线粒体自噬有关。见图5。

注：与正常组比较,**P<0.01;与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01。图5 温肾养肝汤对PD小鼠线粒体自噬通路蛋白表达的影响Fig.5 Effects of Wenshen Yanggan Decoction on mitochondrial autophagy pathway-related protein expressions in PD mice

4 讨论

古代中医典籍中无PD病名的记载,根据PD临床表现其归属于“颤证”范畴,而众多医家认为“颤证”多属内风,病在肝肾[13]。同样,赵杨教授也认为肝肾亏虚,肝风内动,筋脉失养是PD的主要病机,病位在筋脉,与肝、肾、脾密切相关[7],并根据多年临床经验自拟了温肾养肝汤,方中肉苁蓉温补肾阳、润肠通便,乌药温肾散寒,益智仁温脾暖肾、涩精缩尿,山药补肺脾肾,钩藤平肝熄风,白芍养血敛阴，以避免肉苁蓉、乌药温燥引动肝阳。

目前PD动物模型制备主要是利用化学、物理等方法破坏黑质-纹状体DA递质神经系统,产生神经元变性丢失的特异性病理改变[14]。MPTP是一种亲脂性化学试剂,对黑质和纹状体有较强敏感性,其代谢物可被DA能神经元摄取，抑制线粒体复合物活性,导致DA能神经元变性,进而准确模拟出PD患者的运动障碍症状[14]。基于此,选择MPTP作为造模剂复制小鼠PD模型研究温肾养肝汤对PD小鼠的DA能神经元保护作用及其对线粒体功能和自噬途径的影响。

中脑黑质DA能神经元变性丢失,纹状体内DA含量明显降低是PD的主要病理特征。生理情况下,DA是在DA能神经元胞质内由酪氨酸经TH和芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)作用异构脱羧而成,以囊泡形式经轴突末端释放到突触间隙,与突触后受体结合传递信号[15];突触间隙内游离DA被轴突末梢上转运蛋白摄取后,经线粒体单胺氧化酶(MAO)代谢成具有内源性神经毒素的3,4-二羟基苯乙醛(DOPAL),再经乙醛脱氢酶(ALDH)转化为低反应活性的DOPAC,进一步代谢为HVA,维持着DA动态平衡[16]。本实验中,与模型组相比,温肾养肝汤高剂量能显著提高中脑黑质中TH抗体阳性细胞数(P<0.01),且可明显观察到阳性细胞突起,提示温肾养肝汤能保护PD小鼠的DA能神经元;同时对纹状体中DA及其代谢物进行分析,发现高剂量温肾养肝汤能明显提高PD小鼠脑内DA(P<0.01)、HVA含量(P<0.05),降低DOPAC/DA(P<0.01)、HVA/DA(P<0.05),改善DA周转代谢率,进一步证实温肾养肝汤能对抗MPTP诱导的DA能神经元丢失。

线粒体分裂融合的动态性失调与神经元细胞存活以及PD等神经退行性疾病发生密切相关[17]。正常情况下,DA能神经元细胞内线粒体分裂与融合过程的平衡保持着线粒体形态、数量和功能的正常,而在PD疾病状态下,ComplexⅠ被抑制,使线粒体功能缺陷,ROS大量聚集,诱发DA能神经元丢失,同时介导受损线粒体降解的线粒体自噬也被抑制,造成受损细胞器聚集,进一步加剧DA能神经元丢失[18]。PINK1是线粒体质量控制主要调节因子,可被线粒体损伤因素激活,磷酸化Parkin,泛素化线粒体底物,通过VDAC1通道将接头蛋白P62募集到线粒体上,被自噬受体识别后,在连接蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ作用下,被自噬泡招募,启动线粒体自噬,以清除损伤或病变的线粒体；在清除线粒体的过程中,与底物结合的P62也会被蛋白酶水解[18-20]。本实验结果证实,温肾养肝汤能明显提高PD小鼠黑质中ComplexⅠ和ATPase活性,提示温肾养肝汤能改善线粒体功能;同时还能上调黑质线粒体中PINK1、Parkin、VDAC1和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的表达,下调P62蛋白表达,提示温肾养肝汤能恢复PD小鼠黑质线粒体自噬,及时清除受损的线粒体。

综上所述,温肾养肝汤能保护PD小鼠的DA能神经元,提高脑内DA含量,改善小鼠行为学特征,延缓疾病进程,可能与改善线粒体功能,激活PINK1/Parkin介导的线粒体自噬相关。