黑萝卜胞质类型的分子鉴定与育种利用

李晓梅 杨峰 雍晓平 冉茂林

摘    要：萝卜胞质类型鉴定是杂种优势利用的前提。以NWB/DCGMS CMS及Ogura CMS两个萝卜细胞质雄性不育特异基因设计引物，对3份黑萝卜材料进行胞质类型鉴定。结果表明，3份可育黑萝卜资源均含有NWB/DCGMS CMS不育主控基因orf463，利用3份黑萝卜为母本与其他萝卜构建的F2代遗传群体表现出育性分离现象，根据育性分离比发现黑萝卜R3、R4含2对恢复基因，黑萝卜R5含3对恢复基因。同时，利用黑萝卜含有NWB/DCGMS CMS线粒体不育主控基因及细胞核恢复基因的特性，进行了不育系及恢复系的创制选育，为萝卜NWB/DCGMS CMS杂交品种的选育利用提供了技术支撑。

关键词：黑萝卜;细胞质雄性不育;育种利用

中图分类号：S631.1 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2022）02-007-05

Molecular identification of cytoplasm types of black radish（Raphanus sativus L. var. niger）and the breeding utilization

LI Xiaomei1，2，3， YANG Feng1，3， YONG Xiaoping1， RAN Maolin1，3

（1. Rice and Sorghum Research Institute， Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Deyang 618000， Sichuan， China; 2. College of Horticulture， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， Sichuan， China; 3. Vegetable Germplasm Innovation and Variety Improvement Key Laboratory of Sichuan， Chengdu 610300， Sichuan ， China）

Abstract：The identification of radish cytoplasm is the prerequisite for the utilization of heterosis. We used NWB/DCGMS and Ogura CMS gene specific primers to identify the cytoplasm types of three black radish lines. The result showed that all three fertile black radishes had NWB/DCGMS CMS major gene orf463. The segregation of F2’s using the three black radishes as female parents and other radish as male parents suggest that black radish R3， R4 carried 2 pairs of restorer genes， and black radish R5 carried 3 pairs of restorer genes. Taking advantage of black radish having both NWB/DCGMS CMS mitochondrial sterility gene and nuclear restorer gene， we carried out the breeding of sterile lines and restorer lines to provide resources for breeding and utilization of NWB/DCGMS CMS hybrids.

Key words： Black radish; Cytoplasmic male sterility; Breeding utilization

黑蘿卜（Raphanus sativus L.var.niger）是萝卜属普通种的一个变种，其根皮黑色，圆形或圆柱形[1-2]。黑萝卜主要分布在欧洲，不仅是当地的根类蔬菜，也是重要的药用化合物来源，许多研究表明其内部主要活性物质为硫代葡萄糖苷，可被用于治疗肝、尿、胆、胃肠、心血管和癌症等疾病[3-6]。中国地区以消费各类大根类型萝卜（Raphanus sativus L.var. hortensis）为主，至今国内只有一例关于黑萝卜品种选育的报道[7]。

Yamagishi和Terachi[8]在对已测序的8个萝卜线粒体基因组进行比对研究时发现，黑萝卜线粒体含有DCGMS CMS不育主控基因orf463。DCGMS CMS是韩国学者Lee等[9]从一份引自于乌兹别克斯坦的萝卜材料中发现，该胞质不育类型花药上有少量无功能花粉，败育发生在单核小孢子时期，且在萝卜品种中存在广泛的保持源，此特征与Nahm等[10]报道的NWB CMS相似，但与Ogura CMS差异较大，是一类新的萝卜胞质不育类型。Park等[11]通过线粒体基因组测序推测orf463为DCGMS CMS不育主控基因。随后，Yamagishi等[12]发现orf463基因广泛存在于黑萝卜中，且同一黑萝卜线粒体中DCGMS CMS线粒体结构类型与已测序日本黑萝卜线粒体结构类型并存，只是不同材料2种类型的亚计量不同。Wang等[13]通过对NWB CMS线粒体基因组测序发现，NWB CMS与日本黑萝卜线粒体基因组序列与结构完全一致，与DCGMS CMS仅存在结构上的差异，是同分异构型，以上两项研究从分子与线粒体基因组水平证实NWB CMS与DCGMS CMS属于同一不育胞质类型，且广泛存在于黑萝卜中。

NWB/DCGMS CMS在萝卜种质资源中具有广泛的保持源[9-10]，因此极易选育出不育的F1代杂交品种，可很好保护育种者的知识产权，近年来该类型品种日益增多，如韩国世农种业的“301”“501”系列等。但与此同时，恢复材料的缺乏导致此类品种的优良性状难以利用，长此以往将导致大量萝卜种质资源的丢失。虽然黑萝卜不适合国内消费习惯，但其内含有NWB/DCGMS CMS不育主控基因与相应恢复基因，因此育种利用价值较大。四川省农业科学院水稻高粱研究所萝卜课题组2016年从国外引进了3份黑萝卜资源，随后对其胞质进行了鉴定，并以其开展了NWB/DCGMS CMS不育系与恢复系的选育研究，可为国内研究者对NWB/DCGMS CMS胞质及其恢复基因的深入研究与育种应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

参试的10份萝卜材料均为四川省农业科学院水稻高粱研究所萝卜课题组选育或引进，其中Ogura CMS及NWB CMS不育系各1份（不育胞质对照组）、黑萝卜3份（图1）、其他不同类型萝卜品种（品系）5个，材料详情见表1。所有材料于2016年9月至2021年5月种植于四川省农业科学院水稻高粱研究所德阳市大同试验基地，每年秋冬季进行根、叶性状评价，春季进行育性鉴定与材料创制。

1.2 萝卜胞质类型的鉴定

根据DCGMS CMS线粒体基因组（Genebank ID：KC193578.1）中orf463序列设计特异引物orf463-F/R，同时以Ogura CMS特异引物[14]对试验材料胞质类型进行鉴定，各引物序列见表2。植物DNA提取按照TIANGEN公司通用型植物DNA提取试剂盒产品说明进行，PCR反应体系为25 μL，含40 ng DNA，2.5 μL 10×Taq Plus Buffer（含Mg2+），2 μL 2.5 mmol·L-1 Super pure dNTPs，0.5 μL 10 μmol·L-1正向引物，0.5 μL 10 μmol·L-1反向引物，0.5 μL 2.5 U·μL-1 Taq Plus，用ddH2O补齐25 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性4 min;94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30次循环;最后72 ℃延伸10 min。 PCR产物于1.2%琼脂糖凝胶上电泳检测。

1.3 黑萝卜的育种利用

1.3.1    NWB CMS不育源的创制与不育系的选育    以可扩增出orf463特异基因的3份黑萝卜为母本，以试验材料中的R8为父本，构建F1、F2群体，并对遗传群体进行育性分析，然后对育性调查结果进行χ2检验，分析黑萝卜内恢复基因对数。同时以上述不育株为母本，以R6～R10为回交父本，进行不育系的选育。

1.3.2    NWB CMS恢复系的创制    以黑萝卜R4为母本，白长根萝卜材料R8为父本，获得F1代材料，然后以F1为母本，R8为轮回父本，每代选择可育回交后代为母本，回交3代性状基本与轮回亲本一致后，进行自交，选择自交后代育性不分离的材料，即可获得含NWB CMS纯合恢复基因的材料。

2 结果与分析

2.1 萝卜胞质类型分子标记鉴定结果

利用DCGMS CMS与Ogura CMS特异引物对试验材料进行PCR扩增，并对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果可知，3份黑萝卜可扩增出orf463特异基因片段（图2-a），证实其含有NWB/DCGMS CMS不育主控基因，但所有黑萝卜材料均可育，说明其细胞核携带恢复基因R8材料可扩增出orf138特异片段（图2-b），其为Ogura CMS的杂交品种。R6、R7、R9、R10未能扩增出两类不育胞质特异片段，为普通胞质类型。

2.2 不育源的创制与不育系的选育

以3份不同来源的黑萝卜为母本，以R8为父本构建F1、F2群体，各群体育性情况见表2。由表2可知，F1群体全部可育，F2呈现不同的育性分离比例，说明其细胞核内所含恢复基因对数不同。以黑萝卜R3、R4构建的F2群体可育株与不育株分离比经χ2检验符合2对完全显性基因遗传特性，而以R5构建的F2群体育性分离比为65.4∶1，经χ2检验符合3对完全显性基因遗传特性，这与笔者团队以黑萝卜为父本的检验结果一致[15]。

试验以黑萝卜创制的不育株为母本，以R6～R10为回交父本，进行不育系的选育，现已选育回交BC4代的NWB/DCGMS CMS各类萝卜不育系5份（图3）。

2.3 NWB/DCGMS CMS恢复系的创制与利用

以黑萝卜R4为母本，R8为回交父本进行NWB/DCGMS CMS恢复系的创制，由图4-a可知，其F1代黑萝卜的皮色除根颈部少量黑色，其余根皮均白色，由此说明，黑萝卜的皮色容易改良。后续每代选择可育株做母本（说明其内含恢复基因），R8为回交父本，回交3代后其基本性状即与回交父本相似，再进行自交，选择自交育性不分离材料即为含NWB/DCGMS CMS纯合恢复基因的材料（图4-b）。

3 讨论与结论

萝卜为典型的异花授粉植物，其杂交优势明显，利用细胞质雄性不育系做母本进行杂交制种是当前萝卜杂种优势利用的主要途径。因此，开展萝卜雄性不育胞质类型分类鉴定是萝卜杂交品种选育的前提。现今，已报道的萝卜胞质类型主要有Ogura CMS及NWB/DCGMS CMS，其线粒体不育主控基因分别为orf138与orf463，根据不育主控基因設计引物即可对萝卜胞质类型进行准确鉴定。笔者以两个胞质不育基因设计特异引物筛选到3份黑萝卜资源含有NWB/DCGMS CMS不育基因，这与YAMAGISHI等的研究结果一致[12]。

前人研究表明，NWB/DCGMS CMS在萝卜中恢复材料极少，只有少量欧洲萝卜材料含有该不育胞质恢复基因[8]。萝卜以根为收获器官，在育种过程中不需要特定恢复系即可进行杂交品种选育。NWB/DCGMS CMS相比Ogura CMS在萝卜中具有广泛的保持源，因此极易用该胞质配制F1代不育的杂交品种，可很好地保护育种者知识产权[15]。然而，如果缺乏恢复系的该类胞质品种大面积应用会导致育种资源逐渐丢失。本试验鉴定到的3份黑萝卜资源全部可育，说明其含有NWB/DCGMS CMS恢复基因，后续利用3份黑萝卜为母本，以不含恢复基因的材料为父本，分析F2代育性分离情况，发现2份黑萝卜含有2对恢复基因，1份黑萝卜含有3对恢复基因，这一结果与前人研究结果相似[8，12]。

本课题应用黑萝卜创制的不育源，开展了NWB/DCGMS CMS不育系的选育，转育各种萝卜类型不育系5份。同时，利用黑萝卜材料含有NWB/DCGMS CMS恢复基因的特性，创制了含纯合恢复基因的白长根萝卜1份，该恢复材料可用于市场上含orf463特异基因的不育杂交品种优良性状的“固定”，可扩大育种者资源利用范围。本课题组正在开展黑萝卜NWB/DCGMS CMS恢复基因的定位与克隆研究，相信后续研究结果对揭示NWB/DCGMS CMS不育与恢复机制及提高萝卜育种应用效率具有重要的意义。

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