miR-599在宫颈癌患者中的表达变化及其预后价值研究

张瑜，任春娜，刘婵娟，宫玉凤

（牡丹江医学院附属第二医院检验科，黑龙江 牡丹江 157000）

宫颈癌在女性恶性肿瘤中较为常见，其主要的病发原因是人乳头病毒HPV的感染，也可能与个人生活方式及遗传因素相关[1]。随着诊断及治疗技术的发展，该病病发率及病死率不断下降，预后也有了一定程度的改善，但患者3 年期生存率仍处于较低水平[2-3]。miRNA属于内生非编码RNA分子的一种，可调节细胞生命活动，miRNA表达水平的异常，可能预示癌症细胞的发生与增殖[4]。miR-599 全称MicroRNA-599，已有研究证明，miR-599在卵巢癌、乳腺癌的发生发展中具有重要作用[5]。但关于其对宫颈癌的临床症状表达及预后的影响鲜有研究。基于此，本研究拟对miR-599 进行实时定量荧光PCR 检测，以了解其在宫颈癌发生发展中的作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取 2018 年 1 月至 2021 年 1 月本院收治的宫颈癌患者60例，平均年龄（55.7±1.2）岁。本研究经医院伦理会审核批准。患者均对本研究知情并签署知情同意书。纳入标准：①病理组织活检确诊为宫颈癌；②首次发病；③手术期间未死亡；④无远处转移。排除标准：①临床资料不完整者；②合并其他恶性肿瘤者；③术前放化疗者；④合并糖尿病、高血压、冠心病者。

1.2 方法

1.2.1 获取标本 于术后采集所有患者癌组织标本及癌旁组织标本，使用RNA 提取盒提取RNA 并使用miRNA 逆转录试剂盒合成单链cDNA，在EP管中保存分装，于-80 ℃环境下冷藏。

1.2.2 定量荧光RNA 检测 使用全自动荧光定量PCR 分析仪对miR-599 进行扩增，在95 ℃下反应，总体系为20 μl，反应时间为15 min；之后94 ℃反应15 s；55 ℃反应30 s；70 ℃反应34 s，如此循环40次，最终采集荧光信号并使用2-ΔΔCt方法进行分析。

1.2.3 CCK-8法检测细胞增殖能力 将miR-599类似物在宫颈癌Hela 细胞中转染，在96 孔板中置入Hela 细胞，将孔板置入细胞箱中培养，分别在12、24、36、48、60 h 时加入 CCK-8 试剂，以每孔吸光度分析细胞增殖能力，以此为观察组，并与经过miRNC转染的对照组进行比较。

1.2.4 Transwell 法检测细胞的迁移和侵袭能力将不含20%胎牛血清DMEM/F12培养基置于Tran‐swell板的上室，将含血清的DMEM/F12培养基置于Transwell板的下室，将转染后的细胞适量接种到上室中，培养后对下室细胞进行染色，挑选5 个区域，对区域内的细胞数进行分析，以确定细胞的迁移能力。使用覆盖基质胶的膜分隔上下室，进行细胞侵袭的分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料以“”表示，采用t检验，计数资料以例数（n）表示，采用χ2检验，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同细胞组织中miR-599 的表达情况 宫颈癌患者癌性组织内miR-599的表达水平明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 不同组织中miR-599的表达水平比较（）Table 1 Comparison of the expression levels of miR-599 in different tissues()

表1 不同组织中miR-599的表达水平比较（）Table 1 Comparison of the expression levels of miR-599 in different tissues()

组别癌性组织癌旁正常组织t值P值例数60 60 miR-599/U6 1.02±0.24 0.87±0.21 5.589 0.005

2.2 miR-599的表达与宫颈癌临床病理参数之间的关系 以U6表达量标定为相对表达量参考，＜U6=1 为低表达，＞U6=1 为高表达，结果显示，miR-599的表达与宫颈癌FIGO 分期、宫颈癌病理组织分化有关（P＜0.05），见表2。

表2 宫颈癌血清miR-599表达与临床病理参数之间的关系Table 2 The relationship between serum miR-599 expression and clinicopathological parameters in cervical cancer

2.3 miR-599 的表达与宫颈癌细胞增殖及侵袭的关系 实验结果显示，在下调Hela 细胞中的miR-599 表达后，采用 CCK-8 法从第 48 小时开始，Hela细胞的增殖能力明显低于对照组（P＜0.05），而侵袭下室的细胞数明显少于对照组（P＜0.05），见表3。

表3 下调miR-599表达后Hela细胞中增殖能力比较（）Table 3 Comparison of proliferation ability in Hela cells after down-regulating the expression of miR-599()

表3 下调miR-599表达后Hela细胞中增殖能力比较（）Table 3 Comparison of proliferation ability in Hela cells after down-regulating the expression of miR-599()

组别对照组（n=60）观察组（n=60）t值P值12 h 0.43±0.11 0.44±0.12 0.476 0.456 24 h 0.72±0.21 0.67±0.25 0.291 0.321 36 h 1.52±0.24 1.42±0.36 0.423 0.352 48 h 2.59±0.54 2.07±0.75 2.765 0.012 60 h 3.32±0.93 2.52±0.99 3.283 0.015侵袭细胞数（个）103.45±13.12 53.54±10.43 4.355 0.001

2.4 miR-599的表达与预后生存期的关系 将患者按照miR-599表达水平的不同划分为低表达组与高表达组，统计两组患者预后生存期发现，1年、2年存活率比较差异无统计学意义，高表达者3 年期存活率低于低表达者，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 不同表达的miR-599水平的患者预后生存期比较[n（%）]Table 4 Comparison of prognosis and survival of patients with different expression levels of miR-599[n(%)]

3 讨论

宫颈癌原发于女性子宫颈部，是由HPV病毒感染所致，其临床症状根据患者个体差异有不同的表现，初期可能无任何症状，但随着疾病的发展，患者可能出现接触性流血或阴道流血，伴随贫血、气虚、发热、四肢酸痛等症状，疾病晚期会出现肾功能损害、身体消瘦、大出血等严重症状，危及患者生命安全[6-7]。因此，探寻宫颈癌的发病机制，寻找生物标记分子的不同表达与临床及预后的关系，对于宫颈癌的诊断与治疗具有重要意义[8]。miRNA是真核生物细胞单链非编码RNA 的一种，包含有18～25 个核苷酸，可参与基因转录和表达，能调节细胞的增殖、分化及凋亡[9]。miRNA包含众多成员，有研究发现，miR216-a的下调，与患者肿瘤分化、肿瘤形态及大小、肿瘤的远处转移均密切相关，能影响细胞的增殖、迁徙、与侵袭[10]。说明miRNA 对于癌症的发生和发展具有促进作用，可作为治疗癌症的新靶点。miR-599 广泛存在于哺乳动物的细胞和组织中，有研究表明，miR-599下调可参与乳腺癌的发生与发展，对于癌细胞的增殖与侵袭具有抑制作用[11]。

本研究结果显示，宫颈癌患者癌性组织内miR-599 的表达水平明显高于癌旁正常组织（P＜0.05），提示miR-599可参与宫颈癌的早期诊断。本研究结果还显示，miR-599 的表达与患者临床病理参数的FIGO 分期及肿瘤组织分化相关（P＜0.05），说明miR-599的表达对于宫颈癌疾病的临床病理可起到一定预测作用。有研究[12]对于miR-599在卵巢癌中的表达与细胞的侵袭与增殖进行研究，结果显示miR-599 在卵巢癌细胞中呈现高表达，且下调miR-599的表达可抑制癌细胞的分化与增殖。本研究结果显示，在下调宫颈癌患者Hela 细胞中的miR-599表达后，细胞的增殖能力与侵袭能力明显降低，提示miR-599 有望成为抑制宫颈癌细胞增殖的新靶点。在对预后的统计分析中，miR-599 高表达的患者3年期存活率明显低于低表达者（P＜0.05），提示miR-599 的高表达与宫颈癌患者的生存率相关，可作为预测宫颈癌患者预后的预测因子[13]。

宫颈癌患者癌性组织中miR-599的表达明显高于非癌组织，miR-599的表达与病理组织分化、细胞的增殖与侵袭能力、患者存活率密切相关，可作为诊断及治疗中的预测因子。