豆科植物结瘤自调控分子机制研究进展

张雪，邱丽娟，阎哲

(1.中国科学院 东北地理与农业生态研究所，吉林 长春 130102；2.中国科学院大学，北京 100049；3.中国农业科学院作物科学研究所/国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程/农业部种质资源利用重点实验室，北京 100081)

0 引 言

氮是植物生长发育的必需元素。在自然界中，虽然大气中富含氮气(N2)，但土壤中的含氮量很有限。当土壤可利用氮素匮乏时，豆科植物可以与相匹配根瘤菌共生互作形成根瘤，并将氮气转化成植物可以吸收利用的氨。植物宿主为根瘤菌提供适宜的生存空间、必要养分和高效固氮环境，而根瘤菌通过自身固氮酶的作用，为宿主提供氮素[1-2]。目前，这种生物固氮方式已经被许多国家应用于农业生产，既提高了豆科作物品质和产量，又有效地减少了过量施用氮肥所导致的农田生态环境破坏以及水体污染[3-6]。

在宿主植物缺乏氮素的情况下，豆科植物与根瘤菌形成共生体，通过共生固氮来获取供植物生长发育的氮。但共生对于宿主植物也是个能量消耗的过程，宿主植物需要提供足够的碳源来维持根瘤菌的生物活动，因此，过量结瘤同样会对植物生长发育带来不利影响。为此，豆科植物形成了结瘤自调控AON(Autoregulation of Nodulation)体系，用以维持最佳的结瘤数量，平衡个体生长发育的氮素需求和结瘤固氮能量消耗。本文对近年来AON分子机制相关研究结果进行了整理，重点对调控结瘤数量的关键基因以及AON中长距离运输信号相关研究的进展进行总结，为后续的相关研究提供信息和参考。

1 根瘤形成过程及信号分子

豆科植物与根瘤菌的共生互作是分子信号交互的复杂过程。目前，对豆科植物与根瘤菌共生固氮的分子机制研究主要集中在百脉根(Lotusjaponicus)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)和大豆(GlycinemaxL.)等植物上[7-8]。豆科植物与根瘤菌共生过程大致可分为信号识别、根瘤菌侵染和根瘤发育三个阶段。共生初始，宿主植物与相适根瘤菌通过分子信号交互识别，从而激活共生通路。随后根毛形变，根瘤菌进入根毛，在根毛细胞内形成侵染线，根瘤菌通过侵染线进入根皮层。在根瘤菌侵染的同时根皮层细胞分化形成根瘤原基，根瘤菌通过侵染线定殖于根瘤原基中，根瘤菌特化形成类菌体，根瘤原基发育成为具有固氮功能的成熟根瘤[9]。

近20多年来，科学家通过分子生物学等手段，对结瘤固氮的分子机制有了比较深入的了解。在植物缺乏氮素的情况下，豆科植物根系会释放出类黄酮等物质信号，该信号可以被根系附近的根瘤菌所识别，并激活根瘤菌释放脂几丁质寡糖类物质—结瘤因子(Nod factor，NF)[10]。豆科植物根表皮表达的结瘤因子受体激酶蛋白NFR1和NFR5(Nod factor receptor，NFR)感知结瘤因子信号，从而激活共生体信号通路(Common symbiotic signaling pathway)基因的表达[11-12]。根瘤菌接触根表皮时，另一个受体激酶蛋白EPR3被诱导表达，通过识别根瘤菌的胞外多糖(EPS)进一步对匹配根瘤菌进行识别[13]。在根瘤菌激活宿主的共生信号通路中，NiCK4与NFR5结合互作，并在NFR1/NFR5信号调控下，从细胞膜转移到细胞核，调控下游根瘤的形成与发育[14]。SYMRK受NFR1/NFR5信号调控，介导离子通道蛋白、核孔蛋白等[15]在根毛内产生钙离子振荡，从而促进侵染线的形成和根瘤菌的入侵[16]。钙离子振荡信号被钙-钙素依赖性蛋白激酶CCaMK所识别后，CCaMK结合并磷酸化CYCLOPS，进一步促进结瘤信号通道蛋白基因NSP1和NSP2的表达[17]。NSP1和NSP2蛋白互做形成复合体，进一步调控下游固氮结瘤关键基因如NIN的表达[18]。NIN是最早被发现参与结瘤调控的转录因子之一[19]，其调控一系列关键基因，如正向调控细胞分裂素受体蛋白CRE1[20]，同时限制EOND11的时空表达[21]，从而调控根瘤的发育。

2 豆科植物结瘤自调控(AON)通路中关键基因的功能

2.1 地上受体激酶在AON中的功能

豆科植物在共生固氮的过程中形成了一套精密的结瘤自我调节机制(AON)。通过AON信号通路，豆科植物可以针对环境有效氮素的多少做出相应调节，确保共生过程中结瘤固氮的充足，同时避免过多结瘤所导致的能量损耗。大豆的超结瘤突变体的嫁接实验发现，虽然结瘤发生在地下的根部，但大豆结瘤数量受地上组织的调控[22]。通过对不同豆科植物的超结瘤突变体进行基因定位，证明地上调控结瘤数量的是一个编码CLAVATA1(CLV1)受体激酶的基因。在非豆科植物拟南芥中，CLV1主要参与调控茎端分生组织的增殖与分化等重要的发育过程[23]，而在豆科植物中，CLV1受体激酶在叶片的韧皮部细胞特异性表达[24]，其突变体导致豆科植物根部形成超级结瘤的现象。目前已在不同豆科植物中鉴定出了编码CLV1的同源基因，如百脉根的LjHAR1、豌豆的PsSYM29、苜蓿的MtSUNN、菜豆的PvNARK和大豆的GmNARK等基因[25-28]。Crook等[29]在sunn基因突变体植株中表达被标记的SUNN，结果显示豆科植物CLV1受体激酶蛋白在细胞膜上表达。

地上组织除了CLV1参与AON通路之外，Oka-Kira等[30]分离出百脉根klavier(klv)突变体，该突变体导致超结瘤表型，同时对硝酸盐耐受度显著提高。研究显示，KLV基因编码一种受体激酶，可以形成同源复合物，或与CLV1受体激酶形成异源复合物，该复合物可能是AON根信号感知的必要条件[31]。

2.2 地下CLE短肽信号在AON中的功能研究

在拟南芥中，研究发现CLV1受体激酶蛋白可以和CLE短肽家族的CLV3直接结合，从而诱导下游的信号通路[32]。在百脉根中，研究人员对百脉根基因组序列进行分析，共鉴定到了39个CLE短肽基因，其中3个在根部表达的CLE短肽基因(LjCLE-RS1、LjCLE-RS2及LjCLE3)受根瘤菌侵染显著调控；通过根转过表达实验证明，LjCLE-RS1和LjCLE-RS2可以显著抑制结瘤，同时利用har1突变体证明LjCLE-RS1和LjCLE-RS2在HAR1上游行使功能[33]。在苜蓿中，研究人员共鉴定到25个CLE短肽基因，其中MtCLE12和MtCLE13受根瘤菌侵染诱导表达，MtCLE12和MtCLE13同样抑制苜蓿的结瘤，并且部分依赖于SUNN基因的存在[34]。Reid等[35]通过对大豆基因组的分析，鉴定出了3个参与大豆结瘤抑制的CLE短肽基因，GmRIC1、GmRIC2和GmNIC1，其中GmRIC1、GmRIC2受根瘤菌侵染调控，而GmNIC1受硝酸盐调控。三者的过表达都能抑制大豆根瘤的产生，其中GmRIC1和GmRIC2的过表达可以几乎完全抑制结瘤的产生。

在豆科植物中鉴定出的与结瘤调控相关的CLE短肽，如百脉根LjCLE-RS1/2、蒺藜苜蓿MtCLE12/13及大豆GmRIC1/2在序列和功能上都具有高度的保守性。CLE短肽前体通常由信号肽、可变结构域和CLE结构域组成[36]。Reid等使用定点突变方法确定GmRIC1的CLE结构域Arg1，Ala3，Pro4，Gly6，Pro7，Asp8，His11和Asn12序列对结瘤抑制活性至关重要[37]。Hastwell等[38]基于序列分析，细化CLE结构域和相邻残基，将大豆CLE肽划分为Ⅰ～Ⅶ类，结果显示，第Ⅵ类完全由根瘤菌诱导的CLE肽及其同源基因组成，而氮素诱导的CLE肽及其同源基因主要集中在第Ⅶ类，这侧面反映了高度保守的氨基酸残基可能是CLE肽的活性中心。

Okamoto等[39]研究发现，百脉根CLE的成熟体具有13个氨基酸，同时Hyp7被阿拉伯糖基化。将羟基化、单阿拉伯糖基化和三阿拉伯糖基化的大豆GmRIC1a和GmRIC2a通过叶柄饲喂豌豆，结果显示仅三阿拉伯糖基化的GmRIC1a和GmRIC1a可以种间抑制野生型豌豆结瘤[40]。Schnabel等[41]进一步发现编码阿拉伯糖基转移酶的基因RDN的突变会导致超结瘤现象，Kassaw等[42]通过嫁接和遗传分析，发现RDN1参与AON通路并作用在SUNN上游，同时RND1在SUNN识别MtCLE12过程中起关键的作用。

Wang等[43]研究了大豆miR172c-GmNNC1-ENOD40模块的调控作用。在没有根瘤菌存在时，大豆转录抑制子NNC1(Nodule Number Control 1)抑制ENOD40基因表达。而根瘤菌侵染大豆根系时，被诱导表达的miR172c转录后调节GmNNC1表达，从而解除了GmNNC1对ENOD40的抑制。随后，Wang等[44]对该研究进行了进一步的补充，发现GmNINa可以激活CLE-RIC1/2的基因转录，而NNC1与之作用相反，并且GmNINa和NNC1对CLE-RIC1/2基因元件的结合表现出竞争性，从而综合调控AON中地下释放的CLE信号。

2.3 根部超结瘤突变体(TML)在AON中的功能研究

Magori等[45]在百脉根中鉴定出一个超结瘤突变体toomuchlove(tml)，该突变体与har1突变体具有类似的结瘤表型。tmlhar1双突变体[45-46]的结瘤表型与tml突变体表型一致，未出现任何结瘤相关的加性效应，说明TML与HAR1共同参与AON长距信号转导的调控通路。tml突变体中过表达根信号肽CLE-RS1/RS2，未发现系统性的结瘤抑制[46]，因此证明TML应该在CLE-RS1/RS2的下游起作用。TML编码一种Kelch Repeat-Containing F-box蛋白，该基因在根和根瘤组织表达，反向嫁接实验证明tml超结瘤表型是由地下基因型决定的[46]，推测TML在HAR1下游作用，HAR1通过释放长距离信号从而调控根部TML对结瘤的抑制。

2.4 AON中地上长距离信号的研究进展

在AON调控体系中，虽然CLV1受体激酶与TML的关键作用已经被鉴定，但地上组织通过CLV1释放何种信号调控TML的分子机制还不清楚。Delves等[22]发现，大豆嫩枝产生信号分子SDI(shoot-derived inhibitor)，经过韧皮部运输到根部，抑制结瘤反应。Lin等[47]通过利用超结瘤和野生型叶片提取物外源施加，证实大豆SDI是一种小分子化合物，其分子量小于1 000 Da，而且热、蛋白酶和核酸酶均不影响SDI的活性。

研究发现，部分植物激素起着地上传递到地下的结瘤抑制信号的作用。在蒺藜苜蓿中，超结瘤sunn突变体较野生型会产生大量的生长素运送到根部[48]。Noorden等[49]利用生长素抑制剂、生长素运输抑制剂以及生长素对幼苗进行处理，发现生长素可以调控结瘤的数量，因此推测生长素可能参与AON途径，作为地上传递到地下的信号。Sasaki等[50]通过对CLE-RS1和CLE-RE2过表达植株以及har1突变体进行检测，发现细胞分裂素的前体iPRP在CLE短肽过表达材料中含量显著提高，而在har1突变体中显著下降。通过在地上部分外源饲喂细胞分裂素，发现细胞分裂素可以通过地上组织运送到地下抑制根部结瘤。进一步实验证明枝源细胞分裂素的产生依赖于一个编码异戊烯基转移酶的基因LjIPT3，而LjIPT3影响结瘤受AON通路中的HAR1调控。

除了植物激素外，最近的研究也发现小分子miRNA也参与到了AON地上地下的信号交互中。Tsikou等[51]发现百脉的miR2111在叶片组织的韧皮部特异表达，且其表达受根瘤菌侵染诱导。通过miR2111过表达以及靶基因分析，发现miR2111通过地上到地下的长距运输，抑制结瘤调控因子TML的表达，从而在根系需要结瘤时维持根部对根瘤菌侵染的敏感性。同时通过将地上与地下组织分离，研究发现miR2111过表达以及tml突变体可以在没有地上组织的情况下仍能与根瘤菌形成根瘤，从而证明了miR2111与TML调控结瘤的关键作用。

2.5 硝酸盐对AON通路的影响机制

在研究豆科植物AON分子机制时，科研人员发现硝酸盐浓度可以影响根部的结瘤，如高硝态氮或铵态氮可以显著抑制豆科植物结瘤数量[52]。在超结瘤突变体中，10 mM的KNO3显著抑制野生型材料的结瘤，部分抑制了tml突变体的结瘤，而har1突变体则对氮素不敏感[45]。Okamoto等[33]将百脉根幼苗在不同浓度的硝酸盐进行处理，对编码CLE短肽的基因进行表达分析，结果显示参与AON调控的CLE短肽也受到氮素的调控，其中LjCLE-RS2受硝酸盐处理诱导表达，在30 mmol·L-1的KNO3条件下LjCLE-RS2转录本积累达到最大值，而LjCLE-RS1表达则受到硝酸盐抑制。在大豆中发现了同样的机制，硝酸盐处理可以显著诱导CLE短肽基因GmNIC1的表达，过表达GmNIC1以CLV1受体激酶GmNARK依赖方式抑制根部结瘤[35]。Mens等[53]鉴定出同时受根瘤菌和硝酸盐诱导的蒺藜苜蓿CLE肽基因MtCLE35。MtCLE35的过表达可以抑制苜蓿的结瘤数量，而MtCLE35抑制作用需要CLE受体激酶SUNN和修饰CLE短肽的阿拉伯糖基转移酶RDN1的参与[53-54]。

Nishida等[55]鉴定出一个百脉根突变体nrsym1(nitrateunresponsivesymbiosis1)，NRSYM1基因编码NIN类蛋白NLP(NIN-LIKE PROTEIN)，在高硝酸盐诱导下，NLP可以直接调节CLE-RS2的表达来抑制结瘤数量。此外，苜蓿中NIN的同源蛋白NLP1可以响应硝酸盐信号，nlp1突变体可以降低外源硝酸盐对其的结瘤抑制，而过表达NLP1导致植株对硝酸盐抑制结瘤极为敏感。进一步研究表明，外源硝酸盐可以调控NLP1使其进入细胞核与NIN形成复合物，进而抑制结瘤反应[56]。

苜蓿地上组织表达的CRA2(CompactRootArchitecture2)编码与MtSUNN同源的短肽受体激酶蛋白，cra2突变体表现出结瘤数量降低和侧根数量增多的表型[57]。通过嫁接实验证明，CRA2与MtSUNN类似，均在地上组织行使功能调控根部的结瘤数量。苜蓿根部表达的CEPs短肽 (C-terminally Encoded Peptides)受低氮条件诱导表达，CEPs过表达与cra2突变体表现出完全反向的表型，侧根生长被抑制，根部结瘤数量增多，即使在高硝酸盐条件下，CEPs仍能促进结瘤数量[58]。在拟南芥中，CRA2的同源基因CEPR1被验证与AtCEP1短肽直接结合[59]。Mohd-Radzman等[60]研究证明，CEPs调控侧根发育和结瘤数量依赖于CRA2受体激酶。Gautrat等[61]进一步研究发现，苜蓿MtCEP通过长距离运输被地上组织CRA2识别后，CRA2通过调控下游基因从而促进miR2111的表达，最终通过抑制TML的表达而促进结瘤的形成。

3 研究展望

豆科植物通过结瘤自调控(AON)信号通路平衡共生过程中氮素的需求以及维持共生的物质能量消耗，该机制的深入解析将有助于人们更好的利用AON途径提高豆科植物的结瘤固氮能力，因此具有极其重要的研究价值。通过前期的研究，AON地上和地下交互的分子调控网络框架已初步形成(图1)，这一复杂的调控系统包括了信号的长距离运输、信号的识别以及不同通路的交互调控，从而能够精细针对不同的环境做出调节。

图1 豆科植物结瘤自调控(AON)的分子机制Fig.1 Molecular mechanisms of autoregulation of nodulation(AON)in legumes

虽然AON的研究已取得了一些进展，但仍有很多关键问题亟待进一步解答：(1)地下信号的挖掘：大豆研究表明，CLE短肽GmRIC1和GmRIC2是AON途径关键的地下信号因子，其长距离运输到地上与GmNARK结合共同调控结瘤的数量。然而，研究发现gmric1/gmric2双突并没有表现出gmnark突变体一样的超结瘤表型[62]。CLE短肽是植物中最庞大的多肽分子家族之一[63]，其中大豆中编码了至少84个CLE基因[38]，而且其中有很多受到根瘤菌和氮素调控，因此，是否有其他CLE肽或其他短肽参与长距离信号调控仍有待于进一步的挖掘；(2)地上关键基因和信号的挖掘：虽然研究已鉴定出地上释放的细胞分裂素及小分子RNA 在长距离运输信号的关键作用，但并不能解释全部AON地上信号的功能。实验证明在地上组织外源施加细胞分裂素可以抑制结瘤，但其他研究也表明细胞分裂素是根瘤形成发育所必需的因子[64]，因此，其在地上和地下作用的差别机理有待于进一步解析；(3)地上受体激酶下游的作用机理：叶片表达的受体激酶CLV1和CRA2在与相应的短肽识别结合后，分别反向和正向调控miR2111的表达，但受体激酶如何调控miR2111的表达的机制仍然不清楚；(4)TML调控结瘤的分子机理：TML基因在地下根和根瘤中特异表达并抑制结瘤的数量。TML编码一个F-box蛋白，但该F-box蛋白通过哪些通路来调控结瘤数量的机制仍然未知；(5)环境因素对AON机制的影响：TML虽然在AON机制中处于HAR1的下游，共同调控根瘤数量。但不同于har1突变体，tml突变体对环境氮素十分敏感，因此，对于环境调控AON通路仍然存在一些其他未知的关键基因有待探索。除了关于分子机制的研究问题外，如何有效利用AON途径提高豆科植物共生固氮能力仍待进一步解决。在豆科植物中clv1和tml突变体虽然可以显著促进结瘤数量，但超结瘤表型并没有提高植株的固氮效率，反而抑制了植株的生长发育，因此，如何在自然资源中挖掘AON关键基因的优异功能单倍型或利用基因编辑手段创制理想的变异材料是后续提高豆科植物结瘤固氮效率仍待解决的问题。