基于生物信息学方法探究ENO1基因在宫颈癌中的表达及其作用机制

王晓旋，张石云，杨益琴，陈 艳，王 淮，马雪艳，刘云春

（1.大理大学基础医学院，云南 大理 671000；2.云南省大理大学第一附属医院妇产科，云南 大理 671000；3.云南省大理白族自治州人民医院妇产科，云南 大理 671000）

宫颈癌（cervical cancer）是常见的妇科恶性肿瘤之一，是仅次于乳腺癌威胁妇女生命健康的第二大杀手[1]。据报道，人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的持续感染是导致宫颈癌发生的重要危险因素[2]。尽管随着HPV 筛查项目和疫苗的普及，宫颈癌的发生率已显著降低，但对于已经发生转移或复发的患者来说，其预后仍较差[3]。因此，寻找更为准确且稳定的生物学靶点及其预后的评价指标具有重要的意义。α-烯醇化酶（ENO1）属三种烯醇酶之一，广泛存在于各种组织细胞中[4，5]，是糖酵解过程的关键酶之一。ENO1 不仅在糖代谢过程中发挥作用，其功能还可因其定位不同而改变，其表达水平可因病理生理、代谢途径、生长状态的不同而有所差异[6，7]。此外，研究表明[8，9]，ENO1 除可促进肿瘤细胞对葡萄糖和乳酸的摄取外，还可直接参与肿瘤细胞的分裂、增殖、转移和凋亡等过程。目前，ENO1 基因与宫颈癌之间的关系尚未明确。本文将利用生物信息学方法，系统分析ENO1 基因在宫颈癌中的表达及其功能特性，旨在寻找宫颈癌的预后指标和潜在的治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 ENO1 基因在宫颈癌中的表达分析 GEPIA（http://gepia.cancer－pku.cn/）数据库[10]可对基因表达谱数据进行动态分析，此数据库是由北京大学研究人员开发，具备基于TCGA 和GTEx 数据集提供快速且可自定义的在线分析功能。本研究借助该数据库来分析ENO1 基因在宫颈癌与癌旁组织的表达情况，共得到两组队列：一组数据来源于TCGA 和GTEx 数据库，另一组数据来源于TCGA 数据库。将界值设定为：|Log2FC|＞1.5，P＜0.05。同时利用该数据库中的生存分析评价ENO1 基因表达对宫颈癌患者生存预后的影响，ENO1 基因按其表达中位数分为高表达组和低表达组。

1.2 ENO1 蛋白表达分析 HPA（http://www.proteinatlas.org/）即人蛋白质数据库，该数据库涵盖了蛋白组学、转录组学以及生物学数据，可迅速获取某种蛋白在细胞或组织（癌和癌旁组织）的表达情况。本研究借助该数据库检索ENO1 基因表达情况，在搜索栏中输入ENO1，可得到该基因在组织、细胞和肿瘤中的表达情况，分别选取宫颈癌和宫颈组织提取出该基因在宫颈鳞癌组织和癌旁组织的免疫组化（immunohistochemistry，IHC）数据。

1.3 预后分析 TCGA（https://cancerge-nome.nih.gov/）数据库[11]几乎包含了人类所有癌症的基因组表达图谱，可提供所需基因组序列，并进行临床信息下载。本研究基于该数据库下载ENO1 基因在宫颈癌和癌旁组织样本（共309 例）的表达谱和宫颈癌患者临床信息（共307 例），设置过滤筛选条件：“case”“cervix uteri”“TCGA”“transcriptome profiling”“Gene Expression Quantification”及“HTSeq-FPKM”。借助perl将下载文件中探针名字转换为基因名字，并用R 软件包分析影响患者的预后因素。

1.4 基因富集分析 利用基因富集分析（GSEA）ENO1 基因表达水平对生物学通路基因集富集的影响。下载准备的.cls、.gct 文件并成功读取后，按默认的加权富集统计方法进行富集分析，并将随机组合次数设置为1000 次，选取好结果保存文件途径，将P＜0.05 且FDR＜0.25 界定为显著富集基因集。

1.5 基因共表达分析 Linked Omics（http://www.linkedomics.org/login.php）数据库功能强大，可在线分析来自TCGA 数据库的肿瘤基因谱、甲基化、拷贝数的改变、基因突变及临床信息等。本研究采用Spearman 相关性分析筛选出与ENO1 基因共表达的基因，并将正负相关排名前50 的基因以热图形式展示。

1.6 统计学方法 数据下载采用R（v3.5.3）软件处理。两组单变量资料若符合正态分布，则采用t检验，否则采用秩和检验；采用Log-rank 检验计算ENO1 基因表达与宫颈癌患者预后的关系；采用Spearman 相关性分析筛选ENO1 基因的共表达基因，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ENO1 基因在宫颈癌组织和癌旁组织的表达比较 ENO1 基因在宫颈癌组织中的表达水平高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 ENO1 基因在宫颈癌与癌旁组织的表达比较

2.2 ENO1 蛋白在宫颈鳞癌组织和癌旁组织的表达比较 ENO1 蛋白在宫颈鳞癌组织中的染色阳性率＞75%，染色强度高，而在癌旁组织染色阳性率为25%～50%，染色强度较弱。免疫组化染色结果显示，相较于正常组织，ENO1 蛋白在宫颈鳞癌组织中表达量高于癌旁组织，且主要定位于细胞质和细胞核，见图2。

图2 ENO1 蛋白在宫颈鳞癌组织和癌旁组织的表达比较

2.3 ENO1 基因与宫颈癌患者的预后分析 ENO1 基因高表达的患者生存预后差，其与患者的总生存期（OS）呈负相关（P＜0.05），见图3。将TCGA 数据库下载的不完整的临床信息剔除后剩余307 例，纳入Cox 风险回归模型分析，单因素Cox 回归分析显示，ENO1 基因表达水平与宫颈癌患者OS 有关（P＜0.05）；多因素Cox 回归分析显示，ENO1 基因的表达可作为评估宫颈癌患者生存预后的独立影响因素（P＜0.05），见表1。

图3 ENO1 基因与宫颈癌患者OS 的关系

表1 ENO1 基因与宫颈癌患者的预后分析

2.4 ENO1 基因富集分析 ENO1 基因高表达主要富集于烟酸和烟酰胺代谢、脂肪酸代谢、过氧化物酶体等一系列与代谢相关的生物学过程，ENO1 基因可通过作用于物质代谢途径影响细胞代谢水平进而调节肿瘤的发生发展，见表2，图4。

图4 ENO1 高表达的宫颈癌组织样本的基因集富集分析

表2 ENO1 基因富集的通路集

2.5 宫颈癌组织中的ENO1 共表达基因分析 借助Linked Omics 数据库，筛选出与该基因具有正负相关性的50 个共表达基因，并以可视化热图形式展示：ALDQA、NOC2L、TUBA1C 等基因与ENO1 基因表达呈正相关，且自上而下依次排列，而RNF103、MCF2L、CAPN5 等基因与该基因呈负相关，并自上而下依次排列，见图5。

图5 宫颈癌组织中与ENO1 基因正负相关的共表达基因

3 讨论

生物信息技术在医学研究领域的应用越来越广泛，尤其是利用高通量、低成本的测序技术为医学研究带来了便利，不断有基于大数据的新计算方法和软件工具的出现，其可以准确快速的处理大型复杂数据集，使医学研究得到了突飞猛进的发展[12，13]。目前，越来越多的研究人员参与癌症机制和治疗靶点的研究，借助各种在线式、交互式数据库，分析癌症的潜在基因靶点，并以此为契机，在细胞水平和临床中进行验证[14，15]。

随着医疗水平的发展，宫颈癌的治疗方法逐渐多样化，且早期宫颈癌患者的预后已得到明显改善，但晚期或复发的宫颈癌患者的预后仍较差。研究显示[16，17]，宫颈癌的发病率呈逐年增长且年轻化的趋势。一直以来，我国将细胞学筛查作为宫颈癌的主要筛查项目，虽可起到一定的早筛作用，但其敏感性仍较低，因此有必要进一步探索宫颈癌的发病机制，探索更具特异性的诊断标志物。

ENO1 基因作为代谢途径，特别是糖代谢途径的一种催化酶，其功能可因在细胞定位的不同、细胞内外的含量不同而发挥不同的作用。当位于细胞内时，ENO1 基因可作为糖酵解过程的关键酶参与糖代谢过程，也可参与肿瘤的糖代谢过程影响肿瘤的发生发展；当位于细胞膜时，ENO1 基因可作为纤溶酶原受体，通过调节纤溶酶的活性加速细胞外机制的降解过程，参与癌细胞的转移与侵袭。ENO1 基因可参与多种恶性肿瘤的病理生理过程。有研究报道[18]，ENO1 基因可通过形成ENO1-MAPK-AKT 信号通路诱导肺癌细胞增殖分化；ENO1 基因高表达可促进肝癌细胞、胃癌细胞的增殖与迁移[19-21]，还可作为纤溶酶原受体发挥作用，促进胰腺癌细胞的侵袭[22]。

本研究显示，ENO1 基因在宫颈癌组织中的表达水平高于癌旁组织；生存分析表明，ENO1 基因高表达与宫颈癌患者的OS 呈负相关，提示ENO1 基因高表达与宫颈癌患者预后不良有关。Cox 分析表明，ENO1 基因可作为评估患者预后的独立影响因素。这些均提示ENO1 基因在宫颈癌发生发展过程中可作为促癌因子发挥作用，同时亦可作为宫颈癌的预后指标。本研究还显示，ENO1 基因功能主要富集于烟酸和烟酰胺代谢、脂肪酸代谢、过氧化物酶体等一系列与代谢相关的生物学过程，推测该基因可能通过调控以上途径来调节细胞周期，从而促进癌细胞增殖。此外，本研究还发现与ENO1 具有正负相关的共表达基因，这些数据可为后续研究奠定理论基础。

综上所述，ENO1 基因在宫颈癌中呈高表达，与宫颈癌的发生发展及预后存在一定关系，有望成为宫颈癌预后评估和治疗的潜在靶点。