日粮能量水平对牦牛生产性能、肉品质和瘤胃菌群的影响

姚喜喜， 陈永珑， 徐成体， 海存秀， 刘皓栋

(1. 青海大学农牧学院， 青海 西宁 810016；2. 青海东牧湾农牧科技开发有限公司， 青海 海东 811600；3. 青海大学畜牧兽医科学院， 青海 西宁 810016；4. 甘肃畜牧工程职业技术学院， 甘肃 武威 733006)

牦牛(Bosgrunniens)最早起源于青藏高原，是我国高海拔地区繁衍的一种珍稀牛品种，也是青藏高原地区的牧民的最重要的生活生产资源[1]。长期以来，牦牛分布区青藏高原艰苦的生态环境和落后的生产方式，造成牦牛养殖和管理方式相对落后，主要依靠自然放牧，很少补充饲料。由于青藏高原植物生长季节较短(4～5个月)，在漫长的冬季，传统放牧制度下的成年牦牛通常会掉膘25%～30%[2]。高寒牧区冬春季节牧草缺乏，导致牦牛营养摄入不足，是牦牛“掉膘”的主要季节，牦牛营养供应不足会影响其机体正常发育，严重时会造成骨骼和肌肉组织停止生长[3]。因此，自然放牧已不能满足牧区经济社会发展的需要，随着科学技术的发展，牦牛的饲养方式也在逐渐发生改变。

近年来，农牧交错带推广的牦牛冷季育肥技术是缩短牦牛养殖周期、提高牦牛生产性状、改善肉品质、加快出栏速率和提高牧民经济效益的重要举措。转变饲养方式和改善冷季营养补饲水平可显著提高牦牛生产性能、肉品质和养殖效益。已有研究通过对比冷季舍饲和放牧2种饲养方式，发现冬季补饲可显著提高阿什旦牦牛、环湖牦牛和麦洼牦牛的生长性能、胴体性状、肉品质和经济效益[4-7]。日粮能量利用率是影响家畜生产性能的主要因素，家畜生产效率的高低主要取决于日粮的能量水平。据报道[8-9]，增加日粮能量水平会显著提高冷季舍饲育肥牦牛的生长性能和屠宰性能。由于牦牛生存环境无污染，牦牛肉品矿物质营养均衡丰富，呈现低脂肪和高蛋白等特点，深受广大消费者喜爱，是公众肉品消费的理想选择。杨媛丽等[10]通过对比传统放牧和育肥2种养殖模式发现，育肥模式显著改善了牦牛背最长肌中的脂肪酸组成和挥发性性风味物质组成。王斌星等[11]研究表明，适宜的日粮净能水平能显著提高牦牛肌肉组织中脂肪酸含量和改善肌肉中氨基酸组成。

瘤胃是反刍动物天然的日粮发酵罐，具有复杂的微环境，日粮经瘤胃微生物发酵转变为挥发性脂肪酸被瘤胃上皮吸收，为动物机体提供能量[12]。韩旭峰[13]研究表明，瘤胃微生物受日粮结构和营养水平的影响。因此，了解日粮能量水平如何通过影响牦牛瘤胃菌群发酵进而改变牦牛的生产性能和肉品质，对于探讨牦牛冷季补饲效果具有重要意义。综上，参考国内外研究现状，本研究从农牧交错带生产实际出发，综合分析不同日粮能量水平对牦牛生长性能、屠宰性能、肉品质和瘤胃菌群的影响，以期为高寒牧区牦牛冷季补饲育肥和牦牛产业提质增效提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计

本试验在青海省西宁市湟中县家源养殖专业合作社开展，采用单因素完全随机区组试验设计，选取30头体重相近((269.75±35.46)kg)、健康状况良好的2岁大通公牦牛，试验设置3个处理组(n=10)，在饲喂定量粗饲料的基础上，分别饲喂低、中、高3个综合净能水平的精料补充料，15天试验预饲期，90天试验正饲期。试验日粮参考《肉牛饲养标准》[14]进行配制。粗饲料以80%全贮玉米和20%小麦秸秆作为基础日粮，精饲料以玉米、麸皮、菜粕、小苏打、盐、预混料为主，分别配制3个综合净能水平[低能量组日粮(5.51 MJ·kg-1)、(中能量组日粮6.22 MJ·kg-1)、高能量组日粮(6.94 MJ·kg-1)]的试验日粮。试验分08∶00和17∶00两次饲喂，在饲喂基础日粮的基础上，分别饲喂3个净能水平的日粮，日粮配方组成及营养水平见表1。

表1 牦牛基础日粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) of yak

1.2 饲养管理

试验开始前，对牛舍进行全面消毒，试验开始时对牛只进行全面消毒、驱虫、免疫和登记耳标。试验过程中，每日做好试验牛只的采食、饮水、反刍行为和排便等的观察和记录工作。试验牦牛饲喂全混合日粮(Total mixed ration，TMR)，TMR制作按照每头牦牛每日4 kg全株青贮玉米、1 kg小麦秸秆和2 kg精饲料配制，每日分08∶00和17∶00两次进行饲喂，试验期间保证牛只自由饮水，且做好牛舍卫生防疫。

1.3 样品采集与测定

1.3.1生长性能、屠宰性能和肉品质样品采集与测定 对试验牦牛的初始体重和试验末重进行测量，根据测量的数据计算出平均日增重(Average daily gain，ADG)。每一组的全混合日粮的剩料重和投料重需要每隔30 d连续记录3 d，同时记录干物质采食量(Dry matter intake，DMI)。至试验结束后，在每个试验组随机选取6头牦牛屠宰(空腹24 h)，并记录胴体重和宰前活重，对眼肌面积和屠宰率进行测定[10]。选取第12～13根肋间背最长肌测定0 h和24 h的pH值、蒸煮损失、肉色和失水率[15]。

1.3.2瘤胃液样品采集与测定 瘤胃液采集：屠宰后，每头牦牛采集75 mL瘤胃液，混匀后过滤，立即检测瘤胃液的pH值，取其中20 mL进行测序分析和提取DNA。采集的瘤胃液马上放入液氮罐，运回实验室于—80℃保存，用于相关指标检测。

瘤胃发酵参数测定：利用王鸿泽[15]的方法测定NH3-N浓度；利用pHSJ-3F仪测定瘤胃液的pH值；利用安捷伦气相色谱仪Agilent 7890A GC System(Agilent，Hewlett Packard，美国)测定瘤胃乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸浓度。

瘤胃细菌多样性高通量测序：根据说明书提取瘤胃液基因组DNA，测定DNA纯度和浓度。以提取的DNA作为模板，PCR扩增16S rRNA的V3—V4区，扩增引物(V3—V4)，338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCT-AAT-3′。建立测序文库，用Illumina Miseq PE300对文库进行了测序[13]。测序结束后，为了得到有用的数据对原始数据进行剪切、拼接和过滤。16S rDNA测序由上海欧易生物医学科技有限公司完成，瘤胃细菌ACE，Chao1，Simpson，Shannon的指数和物种覆盖度利用R software 4.0.0软件计算，最后进行OTU聚类分析微生物群落的组成与差异。

1.4 统计分析

利用单因素方差分析3个日粮能量水平的牦牛生长性能、肉品质、屠宰性能及瘤胃发酵参数，并且采用邓肯法对分析的结果进行多重比较，统计结果以“平均数±标准差”表示，以P<0.05作为差异性显著分析依据。

2 结果与分析

2.1 日粮能量水平对牦牛生长性能的影响

由表2可知，日粮能量水平对牦牛初始体重无显著影响，高能量组牦牛试验末重显著高于中、低能量组，中能量组显著高于低能量组(P<0.05)；高、中能量组牦牛平均日增重无显著差异，但均高于低能量组(P<0.05)；高能量组牦牛干物质采食量显著高于中、低能量组，中能量组显著高于低能量组(P<0.05)。

表2 不同能量水平日粮对牦牛生长性能的影响Table 2 Effects of diets with different energy levels on yak growth performance

2.2 日粮能量水平对牦牛屠宰性能和肉品质的影响

由表3可知，高能量组牦牛的宰前活重、胴体重和屠宰率显著高于中、低能量组(P<0.05)；中能量组牦牛胴体重显著高于低能量组(P<0.05)；高、中能量组牦牛眼肌面积没有显著差异但均显著高于低能量组(P<0.05)；高、中、低3个能量组牦牛背最长肌、肉色a*、肉色b*、蒸煮损失以及失水率组间无显著差异。

表3 不同能量水平日粮对牦牛肉品质和屠宰性能的影响Table 3 Effects of different energy levels on meat quality and slaughter performance of yak

2.3 日粮能量水平对牦牛瘤胃发酵参数的影响

由表4可知，高、中、低3个能量组牦牛瘤胃pH值无显著差异；低、中能量组牦牛瘤胃NH3-N浓度显著高于高能量组牦牛(P<0.05)；低能量组牦牛瘤胃中乙酸浓度显著高于中能量组，中能量组显著高于高能量组(P<0.05)；中能量组牦牛瘤胃中丙酸浓度显著高于高能量组，高能量组显著高于低能量组(P<0.05)；高能量组牦牛瘤胃中异丁酸、丁酸、戊酸浓度和乙丙比显著高于中能量组，中能量组异丁酸、丁酸浓度和乙丙比显著高于低能量组(P<0.05)；高能量组牦牛瘤胃中异戊酸浓度显著高于低能量组(P<0.05)。

表4 日粮能量水平对牦牛瘤胃发酵参数的影响Table 4 Effects of dietary energy levels on the rumen fermentation of yak

2.4 日粮能量水平对牦牛瘤胃菌群组成和相对丰度的影响

由表5可知，低能量组牦牛瘤胃细菌Chao1指数显著高于中能量组,中能量组显著高于高能量组(P<0.05)；低、中能量组牦牛瘤胃细菌ACE指数之间无显著差异，但均显著高于高能量组(P<0.05)；高、中、低3个能量组牦牛瘤胃中细菌Simpson指数、Coverage和Shannon指数无显著差异。

表5 日粮能量水平对牦牛瘤胃细菌菌群Alaph多样性的影响Table 5 Effects of dietary energy levels on Alaph diversity of bacterial flora of the yak rumen

由表6可知，在门水平上，高能量组牦牛瘤胃细菌门水平中拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度显著高于中能量组，中能量组显著高于低能量组(P<0.05)；高能量组厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度显著高于中、低能量组(P<0.05)，中、低能量组间无显著差异。

表6 日粮能量水平对牦牛瘤胃细菌门水平多样性的影响Table 6 Effect of dietary energy levels on diversity of rumen bacteria in yak

由表7可知，在属水平上，高能量组牦牛瘤胃细菌属水平中普雷沃菌属(Prevotella)的相对丰度显著高于中能量组，中能量组显著高于低能量组(P<0.05)；中、低能量组理研菌科RC9菌属(Rikenellaceae_RC9)的相对丰度无显著差异，但均高于高能量组(P<0.05)。

表7 日粮能量水平对牦牛瘤胃细菌属水平多样性的影响Table 7 Effects of dietary energy levels on rumen bacterial diversity in yaks

3 讨论

3.1 日粮能量水平对牦牛生长性能的影响

动物机体的生长发育其实是营养物质在体内消化、吸收、转运和沉积的过程，机体发育易受采食日粮结构和营养水平的影响，合理的日粮配比和营养水平对动物机体发育至关重要。前人有关日粮营养水平对不同品牛生长发育的研究较多，结果不尽一致。Brown等[16]比较不同蛋白质能量比日粮对奶牛生长性能的影响研究结果显示，随日粮蛋白质能量比的增加，奶牛平均干物质采食量和日增重显著增加。李亚茹等[17]报道指出冬季舍饲牦牛生长性能受到日粮能量水平的影响，牦牛平均日增重表现出随日粮能量变化而变化的规律。这与本研究结果一致，当饲喂6.94 MJ·kg-1高能量组日粮时，牦牛的干物质采食量最大、日增重增重最快，且显著高于6.22 MJ·kg-1中等能量组和5.51 MJ·kg-1低能量组。李万栋等[18]研究发现，舍饲条件下通过对生长期牦牛饲喂低营养组(代谢能8.27 MJ·kg-1)、中营养组(代谢能10.22 MJ·kg-1)和高营养组(代谢能11.92 MJ·kg-1)3种不同营养水平的日粮时，日粮能量水平为10.22 MJ·kg-1时牦牛增重效果最好。此外，也有研究表明，日粮能量水平对育肥牦牛生长性能的影响可能还与品种有关，品种之间的差异也会对此造成影响[15]，为此还需进行深入研究。

3.2 日粮能量水平对牦牛屠宰性能和肉品质的影响

研究表明，日粮能量水平的高低会显著影响育肥肉牛宰前活重、胴体质量、净肉质量和眼肌面积[19]。本研究中，饲喂6.94 MJ·kg-1高能量组牦牛宰前活重、胴体重、屠宰率和眼肌面积均显著高于饲喂6.22 MJ·kg-1中等能量组和5.51 MJ·kg-1低能量组牦牛。郭亮等[20]高能量组荷斯坦奶牛的屠宰性能均显著高于低能量组，田生花等[21]研究结果表明低能精料组肉牛的屠宰率、胴体质量以及净肉率显著低于高能精料组，王星凌等[22]研究也发现低精料日粮组肉牛的屠宰性能显著低于高精料日粮组，这与本研究的结果一致。

能够体现动物机体糖原降解的速率的重要依据就是宰后肉pH值，肉色是反映肌肉色、香、味、质几大要素中最直观的指标，肉色的深浅和色度主要受肌肉色素的含量确定，本研究中饲喂6.94 MJ·kg-1高能量组牦牛背最长肌pH值显著高于饲喂6.22 MJ·kg-1中能量组和5.51 MJ·kg-1低能量组牦牛，而肉色的L*值则与pH值相反，与岳康宁等[23]报道的结果一致。

3.3 日粮能量水平对牦牛瘤胃发酵参数的影响

日粮精粗比和营养水平是影响瘤胃pH值的主要因素，能够体现反刍动物瘤胃发酵水平的重要依据就是瘤胃的pH值，瘤胃内pH值的稳定可以使瘤胃微生物能够正常活动，并且时刻保持健康，反刍动物正常瘤胃pH值维持在6～7的适宜范围[24-25]。据报道[25]，将牦牛日粮营养水平由5.32 MJ·kg-1降低到3.72 MJ·kg-1，pH值则由6.75降低到6.67。徐俊等[26]通过体外消化试验的研究表明，增加日粮NDF水平会显著增加瘤胃pH值。本研究中高、中、低3个能量水平日粮瘤胃发酵pH值维持在6.40～6.78的范围，且随日粮能量水平的升高呈下降趋势，结果与上述研究报道一致，原因可能与高能量水平日粮的低NDF水平导致的瘤胃pH值较低有关。

研究表明，当NH3-N浓度为6～30 mg·dL-1时，瘤胃内含氮物质的吸收和利用处于动态平衡[27]，NH3-N浓度对瘤胃中含氮化合物的代谢十分重要[28]。据报道[29]，利木赞牛与本地黄牛杂交一代生长肥育牛瘤胃中的NH3-N浓度受到日粮能量水平的影响，且与日粮能量水平呈负相关关系。王斌星等[30]研究表明饲喂粗蛋白质(CP)水平为14.81%的中、高净能水平日粮的舍饲育肥牦牛瘤胃NH3-N浓度显著低于饲喂低水平日粮组牦牛，这与本研究结果饲喂6.94 MJ·kg-1高能量组和6.22 MJ·kg-1中等能量组牦牛瘤胃NH3-N浓度显著低于5.51 MJ·kg-1低能量组的研究结果一致，说明饲喂中、高能量水平日粮有利于瘤胃NH3-N浓度的增加、瘤胃微生物菌体蛋白的合成和瘤胃氮素的利用。

反刍动物瘤胃微生物发酵能够将日粮中的纤维饲料分解为容易消化吸收并且可为机体提供大部分能量的微生物蛋白、挥发性脂肪酸和氨等物质。丙酸是糖异生代谢过程中的重要物质，所有代谢反应均有丙酸参与，乙酸占机体总氧化代谢的25%～40%[31]。据Li等[32]研究报道，高能量日粮在瘤胃发酵时，丙酸比例会显著升高，而乙酸比例会显著降低。这与本研究随日粮能量水平升高，丙酸浓度相应升高的结论一致，这是由于低能量组日粮NDF水平较高，非可溶性碳水化合物含量相对较多，经瘤胃发酵产生的乙酸较多，而高能量组日粮淀粉含量较多，经瘤胃发酵产生的丙酸较多，糖异生作用的主要物质来源就是丙酸，说明反刍动物为了自身更好地生长和发育，必须保证瘤胃中含有较高浓度的丙酸，因此本研究中饲喂6.94 MJ·kg-1高能量组日粮的牦牛育肥效果最佳。

3.4 日粮能量水平对牦牛瘤胃菌群多样性的影响

瘤胃中不同挥发性脂肪酸浓度与微生物群落组成有关[33]。本试验采用Illumina-Hiseq测序平台，研究不同日粮能量水平对牦牛瘤胃微生物多样性的影响。试验从瘤胃液中共检测到3 109个OTUs，比以往研究多[34]。可能的原因是技术的不断进步，更多的细菌可以被分类和鉴定。ACE和Chao1指标反映了瘤胃微生物的相对丰度。本试验中，随着日粮能量水平的升高，瘤胃细菌的的ACE和Chao1指数均显著降低。由此可见，日粮能量水平会显著影响牦牛瘤胃细菌的丰度，且随日粮能量水平的升高，瘤胃细菌丰度显著降低，这与前人的研究结果一致[35]。但Shannon指数、Simpson指数和物种覆盖度无显著变化，说明日粮能量水平的差异不会影响牦牛瘤胃细菌的多样性[36]。

本研究中共鉴定出24个细菌门，其中以Bacteroidetes门和Firmicutes门相对丰度较高，这两个门被认为是评价反刍动物对能量需求的重要微生物菌门，在其它反刍动物中也有类似报道[37-38]。已有研究表明Bacteroidetes门在水解低聚糖、生产乙酸和丙酸中发挥着重要作用，Firmicutes门参与了各种纤维素和淀粉的降解，以及醋酸、丙酸和丁酸的生产[38]。Liu等[39]通过向牦牛饲喂粗纤维含量为30%的粗饲料日粮和粗纤维含量为15%的精饲料日粮时发现，饲喂2种不同的精粗日粮，瘤胃细菌均表现为Bacteroidetes和Firmicutes相对丰度较高，精饲料组日粮Bacteroidetes和Firmicutes的相对丰度显著高于饲料组，这与本研究结果高能量组日粮瘤胃Bacteroidetes和Firmicutes的相对丰度显著高于中、低能量组日粮的结论一致。Bacteroidetes的主要作用是与复杂大分子结合，将复杂的大分子有机物，如碳水化合物降解为单糖[39]。玉米是一种重要的能量饲料，其主要成分淀粉是一种可溶性碳水化合物，为Bacteroidetes将碳水化合物降解为单糖提供了充足的能量来源。因此，Bacteroidetes在高能量组日粮中的相对丰度显著高于其它2种低能量日粮。

本研究中共鉴定出377个细菌属，Prevotella和Rikenellaceae_RC9是牦牛瘤胃中最丰富的细菌属。Prevotella在其他反刍动物中也有优势[40]。Prevotella具有很强的功能多样性，在瘤胃内广泛参与淀粉、蛋白质、肽和半纤维素的降解[41]。Prevotella产生丙酸，通过糖异生作用在宿主动物维持葡萄糖稳态中发挥着关键作用[42]。Rikenellaceae_RC9，Christensenellaceae_R-7，norank_UCG-011和Prevotellaceae_UCG-001在每个样品中也有相对较高的丰度。Rikenellaceae_RC9与动物健康和人类肥胖有关，也可作为生产醋酸和丙酸发酵的底物[43-44]。本试验中，高能量组日粮中Prevotella和Rikenellaceae_RC9相对丰度显著高于中、低能量组日粮。这是因为高能量组日粮瘤胃中较高的淀粉含量，为Prevotella产生更多丙酸，通过糖异生作用维持宿主动物葡萄糖稳态中发挥了着更大的作用，同时，Rikenellaceae_RC9也改善了高能量组牦牛对能量的摄入，使得更多的营养物质被机体吸收利用，所以高能量组日粮表现出更好的育肥效果。

4 结论

日粮能量水平对牦牛生长性能、屠宰性能、肉品质和瘤胃菌群会产生显著影响。本试验研究结果表明，适宜的冷季牦牛育肥最佳日粮净能水平为6.94 MJ·kg-1，该研究可为冷季牦牛育肥提供数据参考和示范指导。