拉帕替尼对A549人肺癌细胞增殖抑制和凋亡机制的实验研究

黄 洁，陈 实，石 奕，李承红，吴娟娟（江汉大学附属医院/武汉市第六医院呼吸内科，武汉 430025）

肺癌是全球范围内常见的呼吸道肿瘤之一，WHO 统计分析发现2018年全球有超过209 876 人患有肺癌，占新发癌症病例的11.6%，死亡人数1 761 007，占死亡病例的18.4%，5年生存率极低，因此进一步的探讨肺癌发生机制及新的治疗方法具有重要意义[1-3]。研究发现[4-6]，人类表皮生长因子受 体（human epidermal growth factor recpetor，ErbB）能够诱导细胞的转化及肿瘤的形成。ErbB与相应的配体结合后构象发生变化，形成同源二聚体，激活下游信号通路，从而达到诱导细胞的转化及肿瘤形成的作用[7-8]。因此，ErbB 家族蛋白的异常与癌症的发生发展密切相关，抑制该家族蛋白信号传导也成为癌症治疗的重要手段[9-11]。所以，为进一步探讨ErbB 抑制剂对肺癌细胞的凋亡及细胞周期的影响，本研究采用ErbB 抑制剂拉帕替尼（Lapatinib，Lap）干预肺癌细胞，进而探讨其作用机制。

1 材料和方法

1.1 研究对象 本研究为体外研究，主要研究对象为A549 肺癌细胞，购自通派（上海）生物科技有限公司。

1.2 仪器与试剂 拉帕替尼（孟加拉碧康制药，批准文号：H20130750）；DMEM 培养基、胎牛血清购于美国Gibco 公司；二奎啉甲酸法（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒购于南通碧云天生物技术有限公司；兔抗人PI3K，AKT，p-AKT，CyclinD1，p21 及GAPDH 多克隆抗体购于美国Abcam 公司；细胞凋亡检测试剂盒及细胞周期试剂盒均购于南京凯基生物技术有限公司。Epics-XL Ⅱ流式细胞仪购于美国Beckman Coulter 公司；ChemiDocTMXRS 凝胶成像系统为美国伯乐公司产品。

1.3 方法

1.3.1 MTT 法检测细胞活力：将A549 肺癌细胞平铺于96 孔板，培养24 h，2，4，8 μmol/L 的拉帕替尼继续培养48 h，加入MTT 孵育4 h 后去除上清液，每孔细胞中加入150 μl 的二甲基亚砜使结晶物溶解，最后在波长560 nm 处测定A值。

1.3.2 流式细胞术检测细胞凋亡：将A549 细胞平铺于6 孔板，培养24 h，2，4，8 μmol/L 的拉帕替尼继续培养48 h，每组收集1×106/ml 个细胞，并按顺序分别加入Annexin V，PI 染液混匀，于1 h上流式细胞仪检测细胞凋亡并分析。

1.3.3 流式细胞术检测细胞周期：将A549 细胞平铺于6 孔板，培养24 h，2，4，8 μmol/L 的拉帕替尼继续培养48 h，每组收集1×106/ml 个细胞，并按顺序分别加入Rnase，PI 染液，分别于室温下孵育1.5 h，最后上流式细胞仪检测细胞周期并分析。

1.3.4 Western blot 检测细胞中PI3K，p-AKT，CyclinD1，p21 蛋白的表达：收集细胞，加入含有PMSF 的细胞裂解液裂解细胞30 min，于4℃离心30 min，收集上清液。BCA试剂盒测定标本蛋白浓度，并制定蛋白标准曲线。制作8%浓缩胶及12%分离胶。蛋白样品煮沸变性后，取30 μg 上样，进行浓缩及电泳分离，分离电压120V，湿法转聚偏氟乙烯膜。2%BSA 室温封闭1 h，一抗工作液（兔抗人PI3K，AKT，p-AKT，CyclinD1，p21 及GAPDH多克隆抗体，稀释度1∶500），4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)（稀释度1∶1 000），室温孵育1 h，加入化学曝光液后，在凝胶成像系统中曝光，并分析电泳条带灰度值。

1.4 统计学分析 应用SPSS 17.0 软件进行统计分析，符合正态分布及方差齐性的计量资料采用均数± 标准差（±s）表示，组间比较采用配对t检验进行分析。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 拉帕替尼对A549 细胞活力的影响 MTT 实验结果表明：与对照组（0.563±0.056）比较，2，4，8 μmol/L 的拉帕替尼能显著降低A549 细胞活力（0.492±0.050，0.435±0.044，0.356±0.025），差异具有统计学意义（t=2.316,4.402,8.267,均P＜0.05）。

2.2 拉帕替尼对A549 细胞凋亡及细胞周期的影响 见表1 和图1。流式细胞实验结果表明：与对照组比较，2，4，8 μmol/L 的拉帕替尼能显著提高A549细胞早期凋亡率（t=-5.387，-17.921，-19.981，均P＜0.05）及晚期凋亡率（t=-16.174，-19.348，-20.767，均P＜0.05），并使细胞周期G1 期延长（t=-4.535，-7.276，-9.831，均P＜0.05），差异均具有统计学意义。

图1 四组流式细胞图

表1 拉帕替尼对A549 细胞凋亡及细胞周期的影响（±s）

表1 拉帕替尼对A549 细胞凋亡及细胞周期的影响（±s）

项 目对照组拉帕替尼（μmol/L）FP 2 4 8细胞凋亡率早期细胞3.25±0.337.47±1.8913.56±1.3718.74±1.878.3910.000晚期细胞2.78±0.289.32±0.9514.29±1.4319.65±1.9713.4120.000细胞周期G 128.45±2.4536.62±3.6743.23±4.3351.23±5.1210.2190.000 S 46.52±4.4840.21±4.2932.18±3.2423.53±2.539.5570.000 G225.03±2.5023.17±2.3524.59±2.4625.24±2.56.6780.000

2.3 拉帕替尼对A549 细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达量的影响 见表2 和图2。Western blot实验结果表明：与对照组比较，2，4，8 μmol/L的拉帕替尼能显著下调PI3K 表达（t=2.165，5.388，17.822，均P＜0.05）及CyclinD1 表达（t=2.449，16.634，20.208，均P＜0.05），下调p21 表达（t=2.165，4.898，18.416，均P＜0.05），4，8 μmol/L 的拉帕替尼能显著降低AKT 磷酸化水平（t=2.486，18.014，均P＜0.05）。

表2 拉帕替尼对A549 细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达量的影响（±s）

表2 拉帕替尼对A549 细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达量的影响（±s）

项 目对照组拉帕替尼（μmol/L）F P 2 4 8 PI3K/GAPDH0.43±0.040.38±0.040.32±0.030.13±0.0110.4820.000 P-AKT/AKT0.98±0.100.97±0.100.85±0.080.23±0.027.7810.000 CyclinD10.51±0.030.36±0.030.13±0.010.08±0.009.3250.000 p210.45±0.040.40±0.040.35±0.030.14±0.018.3380.000

图2 拉帕替尼对A549 细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达量

3 讨论

随着肺癌患者的逐年增多，临床上对于肺癌治疗方法的探索至关重要。多项研究发现[12-14]，拉帕替尼是ErbB2 及ErbB3 蛋白的抑制剂，已推广到多种肿瘤的临床治疗上，特别是乳腺癌，但对于肺癌的治疗报道较少，因此本研究将从理论上证实拉帕替尼对肺癌的抑制作用。

为进一步探讨ErbB 抑制剂对肺癌细胞的凋亡及细胞周期的影响，本研究采用ErbB 抑制剂拉帕替尼干预肺癌细胞，首先通过MTT 实验检测2，4，8 μmol/L 的拉帕替尼对A549 肺癌细胞活力的影响，结果表明2，4，8 μmol/L 的拉帕替尼A549细胞活力显著低于对照组，说明拉帕替尼能显著的降低A549 肺癌细胞活力，并有利于后续实验的研究。流式细胞实验结果表明拉帕替尼能显著提高细胞早期及晚期凋亡率，使细胞周期阻滞于G1 期。陈涛等[15]发现，拉帕替尼联合紫杉醇能抑制食管癌细胞EC109 的增殖和侵袭、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡，本研究与此结果一致。在其他癌细胞的研究中，也得出相似的作用效果[16]，说明拉帕替尼能显著的降低A549 细胞活力，诱导细胞凋亡，阻滞细胞周期。国内学者研究表明[17]：拉帕替尼用于实体瘤中，常联合卡培他滨治疗，药物能抑制表皮生长因子受体（ErbB1）与人表皮生长因子受体2（ErbB2），均能抑制肿瘤细胞的增殖，其主要作用机制为ErbB 家族蛋白与其相应配体结合后，其构象发生变化，促进受体二聚化，使受体细胞内的酪氨酸激酶互相靠近，活性上升并发生磷酸化，进而将信号传递给磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、Janus 激酶/信号转导与转录激活子（JAK/STAT）等下游信号通路，促进癌症的发生发展[4-5]。

用拉帕替尼作用A549 肺癌细胞，检测其对PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达量的影响，结果表明拉帕替尼能显著下调A549 肺癌细胞中PI3K及CyclinD1 表达，下调p21 表达，降低AKT 的磷酸化水平。刘路等[22]报道拉帕替尼通过抑制PI3K/AKT信号通路、激活P38MAPK 信号通路，从而抑制NB4 细胞增殖、促进NB4 细胞凋亡，且该过程常伴有PI3K/AKT信号通路异常，国外学者研究表明：PI3K/AKT信号通路是“抗凋亡通路”信号传导途径，能直接参与多种实体瘤的发生、发展，亦可参与CyclinD1，p21 等细胞周期蛋白的翻译转录[18-21]。

总之，本研究发现2，4，8 μmol/L 的拉帕替尼能显著降低A549 肺癌细胞的增殖活力，诱导细胞凋亡，阻滞细胞于G1 期，下调A549 细胞中CyclinD1 表达，下调A549 细胞中p21 表达，提示拉帕替尼通过影响PI3K/AKT信号通路能降低A549 肺癌细胞增殖，促进癌细胞凋亡。此研究为拉帕替尼临床用药治疗肺癌提供了最初的理论依据，为进一步的研究提供了实践支撑。

本研究为体外实验，相较于临床研究，仍属于基础研究，再加上研究时间相对较短，均需要进一步研究与探讨。同时，本研究中对数据进行分析与处理时，存在一定的人为误差，下一步将继续深入进行临床研究，为肺癌患者临床用药提供依据。