胰腺癌患者血清lncRNA-SNHG11的表达水平及其临床意义

王东琴，霍浩然，秦瑞峰，袁增江（河北省邯郸市中心医院普外三科,河北邯郸 056001）

关键字：胰腺癌；长链非编码RNA;核仁小分子RNA 宿主基因11

2018年全球胰腺癌新发病例数约46 万，占恶性肿瘤新发病例数的2.5%，死亡病例数约43 万，占恶性肿瘤死亡病例数的4.5%[1]。近年来胰腺癌的发病率和死亡率均逐年增长，严重威胁人们的生命健康[2]。胰腺癌患者的预后极差，5年总体生存率不足10%。胰腺癌的发病部位较为隐匿，因此胰腺癌的早期诊断较为困难[3]。胰腺癌的恶性程度较高，容易发生远端转移，导致胰腺癌患者死亡率较高[4]。影像学诊断在胰腺癌诊断中的作用十分有限，因此寻求可应用于胰腺癌临床诊断、治疗的分子标记物，显得尤为重要[5]。目前研究表明，在肿瘤的发生发展中，长链非编码RNA 在肿瘤细胞增殖、侵袭和转移过程中起到重要的调节作用，具有作为肿瘤诊断和治疗靶点的潜能[6]，其中长链非编码RNA-核仁小分子RNA 宿主基因11(long non-coding RNAsmall nucleolar RNA host gene 11,lncRNA-SNHG11)是一种新发现的具有促癌基因作用的lncRNA 分子，在结直肠癌、肝癌等恶性肿瘤的增殖、侵袭中扮演了非常关键的角色[7-8]，而关于其在胰腺癌中的表达情况、与患者病情进展、预后关系的研究报道较少，本研究通过检测胰腺癌患者癌组织、血清中SNHG11 表达量，以此探讨其在胰腺癌患者中的表达水平及其与患者预后的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集河北省邯郸市中心医院2013年7月～2015年2月期间诊治的胰腺癌患者120例为胰腺癌组，其中男性63 例，女性57 例，年龄39～78 岁，平均年龄64.52±13.29 岁。纳入标准：①经病理学诊断确诊；②完整的临床资料及随访资料；③入院前未接受抗肿瘤治疗。排除标准：①并发其它恶性肿瘤；②存在自身免疫性疾病及全身性感染性疾病；③围手术期死亡患者。肿瘤直径:≤3cm 患者67 例，＞3cm 患者53 例；肿瘤部位位于胰头患者61 例，胰体尾部患者59 例；TNM分期为Ⅰ和Ⅱ期患者81 例，Ⅲ期患者39 例；肿瘤低分化患者48 例，中高分化患者72 例；存在淋巴结转移患者55 例，无淋巴结转移患者65 例。选择同期在本院诊治的120例胰腺炎患者作为胰腺炎组，其中男性65 例，女性55 例，年龄49～79 岁，平均年龄65.79±12.57 岁。选择同期在我院进行体检的120 例健康者作为对照组，其中男性61 例，女性59 例，年龄42～77 岁，平均年龄64.29±12.01 岁。三组研究对象的年龄、性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。我院伦理委员会已批准本研究。

1.2 仪器与试剂 血清糖蛋白抗原199（glycoprotein antigen 199，CA199）采用CA199 检测试剂盒（货号ab196269，美国Abcam 公司）进行检测。lncRNA-SNHG11 采用荧光定量PCR 仪（型号A7500，美国ABI 公司）进行检测，所用试剂盒为MirVana miRNA 提取试剂盒（型号AM1870,美国赛默飞世尔科技公司），lnRcute lncRNA 荧光定量检测试剂盒[货号FP402，天根生化科技(北京)有限公司]。

1.3 方法 胰腺癌、胰腺炎患者入院后(对照组于体检当日)采集空腹静脉血3ml 于离心管中，室温静置30min，3 000r/min 离心15min，离心半径为13cm，收集上清液于干净收集管中，-80℃冻存血清样本，备用。胰腺癌患者术中切取的癌组织及癌旁正常组织，液氮保存，备用。酶联免疫吸附法检测血清CA199水平。MirVana miRNA提取试剂盒提取组织样本、血清总RNA,逆转录后，lnRcute lncRNA 荧光定量检测试剂盒进行定量检测，反应条件：95℃预变性15s，90℃变性30s，75 ℃退火50s，80 ℃延伸1min，共35 个循环。lncRNA-SNHG11 上游引物序列：5’-CCAGG ACAATGAAACCAC-3’，下游引物：5’-AGGAGC CCAAAGTAACAG-3’。内参GAPDH 上游引物序列：5’-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’，下游引物：5’-CAAAGTTGTCAT GGATGHACC-3’。荧光定量PCR 仪采集Ct值。lncRNA-SNHG11 相对表达量采用2-△△Ct表示，△CtlncRNA-SNHG11=CtlncRNA-SNHG11-CtGAPDH，△△Ct=△CtlncRNA-SNHG11-△Ct校准标本。

患者出院为随访起始，以电话随访、门诊复查等方式进行随访，患者出现复发或死亡时则结束随访，末次随访日为2020年2月29日。

1.4 统计学分析 SPSS20.0 软件进行数据分析。均值±标准差（±s）表示计量资料，多组独立样本的比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，两组独立样本的比较采用成组t检验。例数或率表示计数资料，采用卡方（χ2）检验。Kaplan-Meier法及Log-rank 检验进行生存分析。受试者工作特征曲线（receiver operating curve,ROC）评估血清lncRNA-SNHG11 对胰腺癌的诊断价值。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA-SNHG11 表达情况 胰腺癌组织lnc RNA-SNHG11 表达水平6.25±1.74，高于癌旁正常组织的1.21±0.35，差异有统计学意义（t=31.107，P=0.000）。三组血清lncRNA-SNHG11 表达水平分别为：胰腺癌组18.45±4.08，胰腺炎组4.13±1.29，对照组1.05±0.31,三组组间差异具有统计学意义（F=981.460，P=0.000）；胰腺癌组血清lncRNASNHG11 表达水平高于胰腺炎组，差异具有统计学意义（t=36.659，P=0.000），胰腺炎组血清lncRNASNHG11 表达水平高于对照组，差异具有统计学意义（t=25.431，P=0.000）。

2.2 胰腺癌患者血清lncRNA-SNHG11 表达与临床病理参数的关系 见表1。有糖尿病史、有吸烟史、肥胖、饮酒、有慢性胰腺炎、有淋巴结转移、CA199 ≥37U/ml，TNM 分期为Ⅲ期的胰腺癌患者血清lncRNA-SNHG11 表达水平高于无糖尿病史、无吸烟史、非肥胖、不饮酒、无慢性胰腺炎、无淋巴结转移、血清CA199＜37U/ml 和TNM 分期I+II 期的患者，差异有统计学意义（t=2.272～9.586，均P＜0.05）。

表1 胰腺癌患者血清lncRNA-SNHG11 表达与临床病理参数的关系（±s）

表1 胰腺癌患者血清lncRNA-SNHG11 表达与临床病理参数的关系（±s）

临床病理参数nlncRNA-SNHG11相对表达量tP年龄（岁）＜605117.89±3.51 1.458 0.148≥606918.81±3.36性别男6317.95±3.52 1.372 0.173女5718.94±4.37糖尿病史无8117.33±3.28 4.945 0.000有3920.78±4.14吸烟史无7817.27±3.97 4.362 0.000有4220.64±4.16肥胖否8317.11±4.22 4.898 0.000是3721.45±5.03饮酒无8717.95±3.98 2.272 0.025有3319.75±4.17慢性胰腺炎无8518.79±3.95 2.332 0.021有3520.06±4.24血清CA199（U/ml）＜372516.29±2.27 4.100 0.000≥379518.99±3.08肿瘤部位胰头6118.69±4.66 0.681 0.497胰体尾部5918.14±4.15肿瘤直径（cm）≤36718.19±3.47 0.654 0.515＞35318.71±5.23组织分化程度高中分化7217.98±3.37 1.580 0.117低分化4819.08±4.23淋巴结转移无6516.19±2.37 9.586 0.000有5521.06±3.18 TNM 分期I+II8117.19±3.37 6.367 0.000Ⅲ3920.97±3.23

2.3 胰腺癌患者血清lncRNA-SNHG11水平与预后的关系 Kaplan-Meier 生存曲线见图1。患者随访期间无失访。以lncRNA-SNHG11 表达水平的中位数为界，将患者分为lncRNA-SNHG11 低表达患者和lncRNA-SNHG11 高表达患者，lncRNA-SNHG11低表达患者的5年生存率为21.82%（12/55），中位生存期为35 个月，lncRNA-SNHG11 高表达患者的5年生存率7.69%（5/65），中位生存期为29 个月，差异有统计学意义（Log-rankχ2=6.937，P=0.008）。

图1 胰腺癌患者血清lncRNA-SNHG11水平与预后的关系

2.4 血清lncRNA-SNHG11 和CA199水平对胰腺癌的诊断价值分析 ROC 曲线见图2。采用ROC曲线下面积（area under curve,AUC）评估血清lncRNA-SNHG11 和CA199 表达水平对胰腺癌的诊断价值，结果显示，lncRNA-SNHG11 的AUC为0.912（95%CI：0.877～0.945），最佳截断值为18.37，灵敏度、特异度分别为0.75，0.82。CA199的AUC 为0.854（95%CI：0.777～0.899），最佳截断值为37U/ml，灵敏度、特异度分别为0.71，0.73。血清lncRNA-SNHG11 诊断胰腺癌的价值高于血清CA199。

图2 血清lncRNA-SNHG11 和CA199水平对胰腺癌的ROC 曲线

3 讨论

胰腺癌是预后最差的消化系统恶性肿瘤，对放化疗的敏感性较差，临床治疗难度较大，探寻对于胰腺癌诊治具有重要意义的生物标志物，是相关领域的研究热点之一[9]。肿瘤发生发展过程中，lncRNA 通过与基因信使RNA（messenger RNA，mRNA）、微小RNA（miRNA,miR）之间的复杂调控机制，参与调节肿瘤细胞的增殖、转移和凋亡等过程[10-11]。此外，lncRNA 能与蛋白质结合形成lncRNA-蛋白质复合物，也能够促进蛋白质之间形成复合体，参与基因转录、蛋白质的翻译后修饰、降解等过程，在肿瘤细胞周期进展、肿瘤耐药中发挥调节作用[12]。lncRNA 是一种在肿瘤的诊断和治疗中具有较大潜力的新兴肿瘤标志物分子[13-14]。

本研究发现，胰腺癌患者的癌组织及血清lncRNA-SNHG11 表达水平异常上调，且在CA199表达水平较高、淋巴结转移、TNM 分期较高、饮酒、有糖尿病史、有慢性胰腺炎的胰腺癌患者血清中lncRNA-SNHG11 表达水平明显更高。有研究表明长链非编码RNA-核仁小分子RNA 宿主基因15 表达水平上调可促进胶质瘤血管内皮细胞的增殖、迁移及管腔形成，推测lncRNA-SNHG11 在胰腺癌中可发挥相同的作用，导致CA199 等肿瘤标志物水平相应升高；而饮酒、糖尿病、慢性胰腺炎等是较早就被认为是胰腺癌的危险因素[15]。此外，本研究还发现lncRNA-SNHG11 表达与胰腺癌患者预后密切相关，分析其原因可能是由于lncRNASNHG11 能够上调肿瘤转移相关蛋白的表达。王辉等[16]人的研究发现lncRNA-SNHG11 能够激活无翅基因(Wingless，WNT)信号通路。已有研究报道显示缺氧诱导因子-1α 和血管内皮生长因子等肿瘤相关蛋白均是WNT信号通路的下游靶基因[17-18]，因此在胰腺癌中lncRNA-SNHG11 表达上调能够激活缺氧诱导因子-1α 和血管内皮生长因子的表达，进而促进肿瘤血管新生。肿瘤血管的形成一方面能够为胰腺癌细胞提供营养物质和氧气，保证胰腺癌细胞增殖的能量需求。另一方面，胰腺癌细胞能够进入肿瘤血管并借由肿瘤血管发生远端转移。胰腺癌易发生肝转移、十二指肠转移以及胆囊转移，并形成转移灶，从而对患者的肝功能以及消化功能造成严重影响[19]。同时，YE 和XU 等人[20-21]的研究发现lncRNA-SNHG11 能够与肺腺癌转移相关转录物1(metastasis associated in lung adenocarcinoma transcript,MALAT1)和锌指结构反义转录本1(zinc finger antisense 1,ZFAS1)等长链非编码RNA 协同作用，共同促进肿瘤发生发展。丝氨酸-苏氨酸激酶（serine-threonine kinase,AKT）信号通路在肿瘤增殖、转移、肿瘤干细胞形成以及肿瘤免疫逃逸中均起到重要作用，MALAT1 和ZFAS1 均能够激活AKT信号通路，同时CA199 是AKT信号通路的下游靶基因[22]，因此在胰腺癌患者中lncRNA-SNHG11 可能与MALAT1 和ZFAS1 协同活化AKT信号通路，进而促进胰腺癌的发生发展和CA199的表达。ROC曲线分析结果发现lncRNA-SNHG11 在胰腺癌的诊断中具有一定临床价值，分析其原因可能是由于胰腺癌患者病情发展，胰腺癌细胞大量合成lncRNASNHG11 并逐渐分泌至血液当中，使得血液当中的lncRNA-SNHG11 表达水平明显提高[23]。同时在胰腺癌发生早期，部分胰腺癌细胞不具有免疫逃逸功能，因此能够被人体免疫系统所识别并诱导发生肿瘤细胞凋亡，在胰腺癌细胞凋亡过程中lncRNASNHG11 大量释放至组织液，使得肿瘤病灶附近的肿瘤微环境中lncRNA-SNHG11 局部浓度升高，因此检测血清lncRNA-SNHG11 表达水平能够反映胰腺癌的发生发展[24]。值得注意的是，本研究仅分析血清lncRNA-SNHG11 单独诊断胰腺癌的价值，在后续研究中可进一步分析其与肿瘤标志物联合应用对胰腺癌的诊断价值。

综上所述，在胰腺癌患者中血清lncRNA-SNHG11表达水平异常升高，并且与患者淋巴结转移、TNM分期和预后密切相关，在胰腺癌患者的诊断中具有一定临床价值。