高能重离子束诱变选育高蛋白含量杂交构树

刘巧丽，吴照祥*，李彦强，李辉虎，刘 杰，周利斌，余发新

(1.江西省科学院生物资源研究所，330096，南昌；2.江西省科学院，330096，南昌；3.中国科学院近代物理研究所，730000，兰州)

0 引言

构树(Broussonetiapapyrifera)是一种荨麻目桑科的多年生落叶阔叶乔木，对环境条件具有十分良好的适应性，自然分布于我国大部分地区和东南亚各国，是一种典型的乡土树种和先锋植物[1]。人类对构树的开发利用具有悠久的历史，根据利用部位的不同逐渐发展出了包括绿化、饲用、造纸和入药等一系列的利用方式，可以说构树浑身是宝[2]。构树具有速生、适应性强、分布广、易繁殖、热量高、轮伐期短等优良特性，在生态、社会和经济等方面发挥重要的价值[1]。杂交构树是中国科学院植物研究所沈世华研究员在广泛收集野生构树种质资源的基础上结合了常规育种和现代育种方式获得的具有较高饲用价值的创新优质树种。通过进一步观察和研究发现，杂交构树不仅继承了野生构树的诸多优良特性，还表现出了超出野生构树的一些性状特征，如叶片粗蛋白、粗脂肪以及钙等含量显著提高[3]。《中国饲料成分及营养价值表》显示杂交构树叶片多项饲用指标都显著超过1级苜蓿，营养价值更高，是一种优良的饲料资源[4]。作为一种广谱性饲料原料资源，杂交构树可以应用于如猪、牛、羊等大型牲畜[5]，也可以应用于鸡、鸭、兔等小型畜禽，甚至可以应用于龟、鳖、鱼等水产养殖[6]。另外，杂交构树具有对多种生物胁迫和非生物学胁迫的耐受性，还常被应用于废弃地的生态治理或生态修复，包括废弃矿山、尾矿以及石漠化山地等[7]。

随着养殖业的蓬勃发展，杂交构树产业也呈现出井喷的态势，据不完全统计全国80%以上的省份不同程度地参与到杂交构树种植和养殖产业链当中。杂交构树的种植已从原来的四旁种植、散生种植发展到现在的规模化、集约化基地种植[8]。然而，全国各地的杂交构树种质退化严重，产量和质量都很难维持，加上国外多种饲料原料的渗透带来的市场竞争加剧，都使得国内的杂交构树产业发展难以为继。虽然现有杂交构树具有适应性强、生长快速等优良特点，但是其蛋白含量下降难以适应当前杂交构树产业发展的基地化、集约化和规模化的大趋势，因此，亟待通过新兴、高效的科学技术选育适应性更强、生长更快和蛋白含量更高的优良栽培品种，而作为饲料原料的重要用途其蛋白含量的提升是首选。

当前林木新品种选育主要包括3种方式，一是广泛收集野生资源并从中选育，二是通过人工杂交从杂交后代中选育，三是针对木本植物通过芽变等方式选育[9]。杂交构树是一种特殊的种质材料，因其本身就是一个杂交种，不适合常规的育种方法进行品种改良。重离子束作为一种先进的辐射诱变源，在农作物、林木及微生物育种的研究中得到了广泛的应用，开辟了新的交叉学科领域[10]。重离子束辐射诱变因具有变异率高、变异谱宽、稳定周期相对较短、简便易行且不受物种限制等优点而倍受青睐，重离子束诱变育种涉及的植物种类逐年递增[11-12]。近年来，林木辐照诱变育种成果显著[13-14]，表明了利用辐照诱变技术进行构树选育是实际可行的。因此，本研究借助加速重离子对杂交构树组培瓶苗进行辐照诱变处理，并筛选出高蛋白杂交构树良种候选材料。通过平行栽培试验进一步验证高蛋白杂交构树对贫瘠的适应性和粗蛋白积累能力，为该良种的推广应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

杂交构树组培瓶苗原种由中国科学院华南植物园吴国江研究员课题组提供。2017年6—12月期间，利用增殖培养基对杂交构树组培瓶苗进行扩繁。

1.2 方法

1.2.1 组培瓶苗辐照处理 辐照诱变处理是在中国科学院近代物理研究所重离子研究装置(Heavy Ion Research Facility in Lanzhou, HIRFL)生物辐照终端平台上进行。2018年3月上旬将经扩繁的组培瓶苗连带组培瓶一起装入样品台，并用80 MeV/u的高能碳离子束对其进行辐照诱变处理，参照前人有关经济林木辐照诱变的研究，设定中等浓度的辐照为40 Gy[15]，共辐照处理20瓶组培瓶苗，每瓶5株。

1.2.2 组培苗生根、炼苗及移栽 将重离子辐照处理的杂交构树组培瓶苗和对照转接至生根培养基，待生根后转移至炼苗基质(蛭石:珍珠岩:草炭=1:1:1)，温室中炼苗30 d后移出，让幼苗在自然条件下生长，30 d后摘取叶片，经烘干、粉碎和消解等步骤测定其粗蛋白浓度。

1.2.3 高蛋白含量杂交构树扩繁与栽培 为了快速获得杂交构树种苗材料，采用根繁的方式进行种苗培育。根据粗蛋白浓度测定结果，选择粗蛋白浓度最高的组培诱变植株(Irradiation mutagenesis，IM)以及未辐照处理组培苗(CK)为母株，2018年12月将其侧根(半径>1 cm)剪为3～5 cm的根段，直立插入塑料拱棚内的沙床中，浇足水分并保温，进行根繁育苗获得无性系幼苗。2019年4月，选择长势一致的突变株无性系幼苗及对照，进行模拟盆栽试验，栽培基质基本理化性状见表1。模拟盆栽试验在江西省科学院人工气候室内进行，光照强度700 μmol photons·m-2·s-1，设置16 h光照(25 ℃)和8 h黑暗(20 ℃)，相对湿度控制在70%，植物生长45 d后收获。收获前1 d通过称重法测定植物单日耗水量。收获时，先测定株高和叶片数，然后将植株分解为叶片、茎干和根系3个部分，取同位叶进行叶绿素浓度测定，将根系最大长度计为根长，洗净、干燥后测定其生物量。然后将叶片和茎干混合为地上部，再对植株地上部和根系粗蛋白浓度进行测定。

表1 杂交构树栽培基质理化特性

1.2.4 叶绿素及粗蛋白含量的测定 叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量采用二甲基亚砜提取法测定，并以每克鲜重含有叶绿素的毫克数(mg·g-1)表示。植株地上部和根系洗净、烘干后粉碎备用，采用凯氏定氮法测定粗蛋白浓度。

1.3 数据分析

利用Microsoft Excel 2010软件对数据进行处理和图表绘制。统计分析采用SPSS18.0软件进行，显著性检验采用单因素方差分析方法(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 辐照诱变对杂交构树粗蛋白浓度的影响

辐照处理的杂交构树瓶苗经过生根、炼苗和移栽，最终获得了60株组培苗。对这60株组培苗及对照样品叶片粗蛋白浓度进行测定，结果发现其粗蛋白浓度为11.88%～37.94%(干重计)，平均为24.08%，高于未辐照的对照处理。分析还发现，辐照处理多数是促进杂交构树叶片粗蛋白的积累，粗蛋白浓度在对照线以上的组培苗数量(51)远多于对照线下的(9)。

2.2 高蛋白含量杂交构树生长情况

2.2.1 形态特征和日耗水量 高蛋白含量杂交构树的叶片数、株高及根长均显著高于对照组(P<0.05)，且株高差异程度较大，提升幅度达50%。另外，通过称重法测定发现，高蛋白含量杂交构树突变株日耗水量达到36.37 g，显著高于对照处理的34.37 g。

2.2.2 生物量积累 不论是高蛋白含量杂交构树突变株还是对照材料，杂交构树生物量(以干重计)分布都表现出叶片>根系>茎干，叶片干重约为茎干的2.49倍，占到茎叶总干重的70%以上。与对照处理相比较，高蛋白含量杂交构树突变株的叶片、茎干和根系生物量都显著增加，并且根系生物量差异达到极显著水平(P<0.01)。

2.2.3 粗蛋白含量 测定结果表明，FT和CK均呈现出地上部分粗蛋白浓度(以干重计)显著高于根系(P<0.05)。高蛋白含量杂交构树突变株地上部和根系粗蛋白浓度都显著高于对照(P<0.05)，分别提高25.54%和12.67%(图3)。相对于植物地上部而言，高蛋白含量杂交构树突变株根系粗蛋白增加的幅度更明显。

图3 高蛋白含量杂交构树粗蛋白浓度

2.2.4 叶绿素含量 进一步对植物叶片叶绿素含量进行测定，结果发现高蛋白含量杂交构树突变株叶片叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量都显著高于对照材料，其中叶绿素b含量差异达到极极显著水平(P<0.001)，而总叶绿素含量差异达到极显著水平(P<0.01)(图4)。

图4 高蛋白含量杂交构树叶绿素含量

3 讨论

以杂交构树组培瓶苗为试验材料，本研究采用40 Gy的高能碳离子束进行诱变处理，通过筛选得到一批高蛋白杂交构树候选材料，其中叶片粗蛋白浓度最大提升幅度达到77.24%。选择叶片粗蛋白浓度最高的候选植株进行扩繁和平行栽培试验验证了其贫瘠适应性和粗蛋白积累能力。

辐射生物学发展至今已有近百年的历史，与常规的x、γ和中子等中性粒子相比，重离子束属于高传能线密度(Linear energy transfer，LET)辐射，可在单位路径上沉积更高的能量，从而引发复杂的且难以修复的遗传损伤，因此其相对生物学效应较高。因其独特的物理学和生物学特性，重离子束在生物诱变育种实践中表现出变异率高、变异谱宽、变异快、稳定周期短等优点[16]。因此近年来，重离子束诱变育种在国内蓬勃发展，多家科研机构育种成果显著[17-18]。前人关于重离子诱变育种方面的研究主要集中于辐照当代生物学效应，包括存活率、幼苗长势、植株高度、结实率等，也有引发种子育性方面的研究[19]。随着育种进程的推进，重离子诱导经济作物质量方面的研究必将得到极大程度的关注，颉红梅[20]等对豆科和禾本科的牧草种子进行了20Ne10+离子束贯穿处理，筛选出了叶片变厚、叶色深绿、生长势增强的禾本科牧草新株系。以杂交构树组培瓶苗为试验材料，本研究初步探讨了中低剂量加速重离子对作物质量的影响，进一步验证了利用重离子诱变提升经济作物质量的可能，并且重离子诱导的质量改善诱变显著高于恶化诱变(图1)。

图1 辐照处理杂交构树组培苗粗蛋白浓度

通过高蛋白含量杂交构树候选材料的平行栽培试验，发现该材料不仅地上部粗蛋白含量显著高于对照材料，其生长指标(图2)和形态学指标(表2)均显著高于对照，表明重离子诱变导致了杂交构树的生物学产量和综合产量的双提高。前人研究发现重离子诱变引发的作物产量和质量的提升与光合作用的增加关系密切[20-21]，本研究也发现了相似的结果，高蛋白含量杂交构树叶片叶绿素浓度显著高于对照材料(图4)。本研究还发现高蛋白含量杂交构树的根系更加发达(表2)，猜测根系吸收更多的营养物质供给植物生长以及代谢作用，因为根系是植物吸收养分的主要结构[22]。从汲取营养来说，根越深越庞大，获取的营养物质和水分越多，这样需要更多叶光合作用合成有机物。相反，叶多需要更多的营养物质和水。因此，植物地上部分和地下部分的生长与发育存在着相互依赖，相互促进和相互制约的关系，这也很好地印证了生态学上的库源学说理论。高蛋白含量杂交构树平行栽培试验中粗蛋白浓度显著低于初筛(图1和图3)，可能是以下3个方面的原因造成，一是2次测定所采用的部位不完全一致，一般来说植物茎干中粗蛋白浓度显著低于叶片，杂交构树也是如此[23]；二是植物生长时间的不一致，植物粗蛋白的合成与积累是一个不连续的过程[24]；三是2次试验所采用的栽培基质养分含量差异明显，非豆科植物氮素主要是通过根系从基质中获取。基于以上三点，土壤养分的供给以及收获频次都显著影响该高蛋白含量杂交构树材料的品质，所以需要加强这个方面的研究工作。

表2 高蛋白含量杂交构树形态特征及日耗水量

图2 高蛋白含量杂交构树生物量积累

诱变育种的根本是提高自然变异频率，积累遗传变异，从而创造新种质，它是解决常规育种中某些特殊问题和培育新品种的重要方法之一。本研究仅对高蛋白含量杂交构树突变株的生长和部分生理进行了初探，尚未将研究内容深入到DNA水平，有待进一步开展研究。在植物育种领域，重离子束可以诱发不同类型的DNA突变类型，但是中低浓度辐照剂量主要引发点突变和小片段的插入缺失[25-26]，本研究中高蛋白杂交构树突变株突变类型的确定有助于更加精确地解读蛋白质合成与积累分子机理，也将助推重离子辐照诱变育种的快速发展，这是下一步工作的重点。