针刺调节缺血性中风大鼠肠道中短链脂肪酸、氧化三甲胺的研究※

张忠平，张海月

(黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036)

中风会诱发身体多种病理、生理学反应，如影响肺、心、免疫系统和肠道功能等[1]。研究表明，肠道菌群影响中风患者的转归，肠道微生物组会产生大量的生物活性代谢产物，通过调节免疫系统或传入神经元途径影响大脑功能[2]，其中以乙酸、丁酸和丙酸为主的短链脂肪酸(SCFA)代谢物已被证明可轻易穿越血脑屏障[3]。研究表明，肠道菌群代谢物氧化三甲胺(TMAO)会促进动脉粥样硬化，如增强巨噬细胞胆固醇的积累、泡沫细胞形成、动脉壁促炎性变化、促进血小板反应性增强和动脉血栓形成[4]。课题组前期研究已经证明，肠道菌群在中风转归中的重要作用，本研究以大脑中动脉阻塞(MCAO)模型大鼠为研究对象，探究针刺对缺血性中风SCFA、TMAO的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物 所有动物实验均按照实验动物研究方案进行，并得到黑龙江省中医药科学院实验动物伦理委员会批准(H20201001)。SPF级雄性大鼠50只，来源于哈尔滨市医科大学动物实验中心。大鼠周龄6～8周，正常饲养、光照，适应环境1周。

1.2 实验分组 将大鼠随机分为针刺组、手法组、电针组、手术组和空白组，每组10只。造模过程中无大鼠死亡。所有分析均由不知道分组情况的研究人员进行。

2 实验方法

2.1 MCAO模型制备 异氟烷吸入麻醉大鼠，在耳朵和眼睛之间切开一条切口，露出颞骨。将激光多普勒探针固定于大脑中动脉区域上方的头骨上，并将大鼠置于仰卧位。在中线颈部切开1个切口，分离并结扎颈总动脉和左颈外动脉。将1条20 mm的渔线插入颈内动脉，并通过激光多普勒血流信号减少情况确认大脑中动脉闭塞。其中，针刺组、手法组、电针组接受MCAO模型建立，闭塞120 min后将动物重新麻醉并除去鱼线。手术组接受相同的手术程序，只是将鱼线插入并立即取出。对照组未执行任何操作。整个手术过程使用加热垫保持大鼠体温恒定。

2.2 穴位及针具 穴位:百会、膈俞、脾俞、肾俞、后三里，穴位和针刺方法参照《实验针灸学》[5]。针具:安迪牌0.25 mm×25 mm一次性针灸针。

2.3 干预方法

(1)针刺组 固定MCAO模型大鼠，选取以上穴位，用75%酒精棉球常规消毒皮肤，快速针刺，深度为12.5 mm，给予捻转手法1 min，针下出现紧滞感后，不做任何操作，留针15 min。每日1次，连续14 d。

(2)手法组 固定MCAO模型大鼠，选穴、消毒、针刺方法、深度同针刺组。针刺后，行捻转手法1 min。针下出现紧滞感后，行搓针手法，达到气满针摇为宜，留针15 min。每日1次，连续14 d。

(3)电针组 固定MCAO模型大鼠，选穴、消毒、针刺方法、深度同针刺组。针刺后，行捻转手法1 min，针下有紧滞感后，同侧膈俞、肾俞接电针治疗仪，膈俞接正极，肾俞接负极，给予断续波，频率2/10 Hz，时间15 min。每日1次，连续14 d。

(4)手术组、空白组 每日固定大鼠，不做任何治疗，每次15 min。连续14 d。

3 实验结果

3.1 标本采集 收集不同组别大鼠干预前后的粪便，使用16S rDNA测序与分析方法检测SCFA、TMAO含量。

3.2 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件处理数据。计量资料如符合正态分布采用均值±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，若方差不齐或不满足正态分布则采用秩和检验，以中位数(四分位间距)[M(Q)]表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

3.3 结果 干预前，MCAO大鼠的肠道菌群出现明显紊乱现象，针刺组、手法组、电针组SCFA含量(乙酸、丙酸、丁酸)显著降低，明显低于手术组和空白组(P＜0.05);针刺组、手法组、电针组、手术组TMAO含量显著升高，明显高于空白组(P＜0.05)。见表1。干预后，针刺组、手法组、电针组SCFA含量升高，TMAO含量降低，与手术组、空白组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，且手法组优于针刺组、电针组(P＜0.05)。手术组、空白组观察干预前后变化不显著。见表1。

表1 各组大鼠干预前后短链脂肪酸、氧化三甲胺比较[logN/g,M(Q)]

4 讨论

现代研究表明，中风后的恢复过程是一个多细胞过程，包括神经元、驻留的免疫细胞和侵袭大脑的细胞[10]。中风可通过改变肠道微生物组，对中风预后产生影响。目前，肠、脑相互作用的机制尚不明确，根据现有的关于急性脑损伤和恢复期菌-肠-脑轴的机制分析，中风后营养不良会影响关键微生物群衍生代谢产物的产生，从而影响免疫稳态，直接影响中风的预后。SCFA、TMAO是肠道微生物组的关键代谢产物，通过影响T细胞功能，间接调节神经再生环境，以影响中风后的恢复能力[11]。

干预后，针刺组、手法组、电针组SCFA含量提高，TMAO含量降低，与手术组、空白组比较均有统计学意义(P＜0.05)，且手法组优于针刺组、电针组(P＜0.05);而手术组、空白组干预前后变化不显著。该结果提示手法组可明显调节肠道菌群SCFA、TMAO含量，从而减轻神经功能损伤，促进脑组织功能恢复，缩短脑缺血后期康复时间窗。相关研究证实，针刺可调节肠道免疫炎性反应，通过改善肠道菌群的多样性，发挥针灸的治疗作用[12]。陈素辉等[13]发现，在中风后急性干预期，针刺百会和足三里可调节大鼠脑缺血损伤区白细胞介素-6的表达，从而干预脑缺血再灌注损伤大鼠的炎性反应。本研究选穴中，百会为诸阳之会，通行百脉，调节十二经气血，为醒脑开窍要穴;脾俞、肾俞应用搓针调气手法可补气血生化之源，有效调节脏腑经气;膈俞为血会，后三里为调节胃肠气血要穴。各穴相配，手法相应，可有效调节肠道菌群变化。

综上所述，肠道菌群失调是影响中风的重要代谢机制，通过调控肠道菌群可影响其与肠外器官的通讯，但肠道菌群介导的免疫炎症因子、神经递质如何调控中风病理过程，具体机制尚不清楚，还有待进一步实验观察。