枸杞子-丹参对rd10小鼠视网膜Caspase-8、Caspase-12、Caspase-3、αB-crystallin表达的影响

蒋鹏飞，欧晨，彭俊，姚震，田野，杨毅敬，宋厚盼，徐剑，彭清华

1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；3.上海市东方医院，上海 200120

视网膜色素变性（retinitis pigmentosa，RP）是一种遗传性视网膜病，遗传方式有常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传及性连锁隐性遗传等，其特征是双眼发病，慢性进行性视力损害并伴有眼底色素变化，影响全世界约250万人。RP属中医学“高风内障”范畴，古文献多认为由虚所致。彭清华教授认为，“虚中夹瘀”是 RP的主要病机，治当补虚活血。课题组前期研究发现，补虚活血中药枸杞子-丹参对RP模型大鼠有一定治疗作用，可保护RP大鼠视网膜组织结构，但其作用机制尚不明确。目前研究多认为RP视力损失的主要原因是视网膜感光细胞死亡。本研究以RP模型动物rd10小鼠为研究对象，观察枸杞子-丹参对视网膜感光细胞凋亡的影响，探讨枸杞子-丹参治疗RP的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

4周龄SPF级rd10小鼠40只、4周龄SPF级C57小鼠8只，雌雄各半，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物许可证号SYXK（湘）2019-0017。饲养于湖南斯莱克景达实验动物有限公司SPF级动物房，温度（22±2）℃，相对湿度 50%～55%，定期更换垫料，自由摄食饮水。适应性饲养1周后开始实验。

1.2 药物

枸杞子超微配方颗粒，批号190247，规格3 g/袋（相当于饮片10 g），湖南春光九汇现代中药有限公司，临用前取1袋颗粒用40 mL灭菌蒸馏水溶解；丹参超微配方颗粒，批号190131，规格1.8 g/袋（相当于饮片10 g），湖南春光九汇现代中药有限公司，临用前取1袋颗粒用40 mL灭菌蒸馏水溶解；维生素A软胶囊，批号140701，每粒含维生素A 5 000 U，青岛双鲸药业有限公司，使用时先用 DMSO溶解，再稀释成水溶液。

1.3 主要试剂与仪器

Caspase-8、Caspase-3、Caspase-12、αB-晶状体蛋白（αB-crystallin）抗体，英国Abcam公司，货号分别为 ab25901、ab44976、ab62484、ab166839；琼脂糖，西班牙Biowest，批号111860；6×上样缓冲液，北京康为世纪，批号CW0610；mRNA反转录试剂盒，北京康为世纪，批号CW2569；miRNA反转录试剂盒，北京康为世纪，批号CW2141；核酸染料，北京普利莱，批号PB11141。摇床（海门其林贝尔，型号TS-92），恒温箱（北京六一，型号DYY-6C），切片刀（德国徕卡，型号M199），切片机（金华益迪医疗设备有限公司，型号YD-315），包埋机（常州中威电子仪器，型号BMJ-A），荧光显微镜（厦门Motic，型号BA210-T），台式冷冻离心机（湖南湘仪，型号H1650R），荧光定量RCP仪（美国 Thermo，型号 PIKOREAL96），荧光PCR板（美国Thermo，型号SPL0960），电泳仪（北京六一，型号 DYY-2C），电泳槽（北京六一，型号DYCP-31DN），生物样品均质仪（杭州奥盛，型号BioPrep-24）。

1.4 分组与给药

采用随机数字表法将40只rd10小鼠随机分为空白组、对照组、枸杞子组、丹参组、杞参组，每组8只，8只C57小鼠为野生组，各组雌雄分笼饲养。对照组灌胃维生素A溶液（11.25 mg/kg），枸杞子组灌胃枸杞子超微配方颗粒溶液（1.5 g/kg），丹参组灌胃丹参超微配方颗粒溶液（0.9 g/kg），杞参组灌胃枸杞子＋丹参超微配方颗粒溶液（3 g枸杞子超微配方颗粒＋1.8 g丹参超微配方颗粒溶于 40 mL灭菌蒸馏水），野生组与空白组灌胃生理盐水，灌胃剂量均为20 mL/kg，每日1次，连续28 d。

1.5 TUNEL染色检测细胞凋亡

1%苯巴比妥钠（3 mL/kg）腹腔注射麻醉小鼠，75%酒精消毒双眼睑周围皮肤，摘除眼球后脱颈处死小鼠。取视网膜，常规石蜡包埋切片，60 ℃烤片30～60 min，将切片置于二甲苯中 10 min，再依次置于100%、95%、85%、75%乙醇中，每次 5 min，蒸馏水冲洗，Proteinase K孵育30 min，PBS冲洗3 min×3次，DNaseⅠ孵育15 min，PBS冲洗5 min×3次，加入适量1×平衡缓冲液，使其全部覆盖待检样本区域，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗5 min×3次，TdT缓冲液37 ℃孵育60 min，PBS冲洗5 min×3次，37 ℃染核10 min，PBS冲洗5 min×3次，90%甘油封片，荧光显微镜下观察并拍照。

1.6 RT-qPCR检测

Trizol法提取视网膜组织总RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度及纯度；以总RNA为模板，反转录合成cDNA，根据PCR扩增试剂盒说明书配制反应体系混合液，并进行 PCR反应。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.7 免疫组化检测

将石蜡切片浸入柠檬酸盐缓冲液（pH＝6.0），微波炉加热至沸腾，保持沸腾24 min，冷却24 min后取出，0.01 mol/L PBS冲洗3 min×3次，加入3%HO室温孵育5 min，PBS冲洗3 min×3次；滴加Caspase-8（1∶100）、Caspase-3（1∶50）、Caspase-12（1∶100）、αB-crystallin（1∶100）一抗，4 ℃孵育过夜，PBS冲洗5 min×3次，滴加IgG二抗，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗5 min×3次，滴加DAB工作液，室温孵育5 min，苏木素复染10 min，蒸馏水冲洗，PBS返蓝，乙醇逐级脱水，二甲苯透明10 min×2次，中性树胶封片，显微镜下观察。以黄色或棕黄色颗粒为阳性表达，计算阳性表达的平均光密度。

1.8 免疫荧光检测

石蜡切片置于硼氢化钠溶液中室温放置30 min，蒸馏水漂洗5 min，苏丹黑染液染色5 min，蒸馏水冲洗3 min，5%BSA封闭60 min，滴加Caspase-8（1∶100）、Caspase-3（1∶50）、Caspase-12（1∶100）、αB-crystallin（1∶100）一抗，4 ℃孵育过夜，滴加荧光二抗，37 ℃孵育90 min，DAPI染核10 min，缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察并拍照，计算阳性表达的平均荧光强度。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 枸杞子-丹参对小鼠视网膜形态及感光细胞凋亡的影响

野生组小鼠视网膜各层结构排列正常，形态规则，视网膜色素上皮细胞连续，感光细胞核数量正常，视网膜外层未见凋亡细胞；空白组小鼠视网膜结构不清晰，视网膜色素上皮细胞大部分损失，视网膜外层较薄，感光细胞核数量减少，并可见凋亡细胞；对照组小鼠视网膜结构模糊，视网膜色素上皮细胞小部分损失，感光细胞核数量减少，视网膜外层可见凋亡细胞；枸杞子组和丹参组小鼠视网膜结构欠清晰，视网膜色素上皮细胞不连续，感光细胞核数量减少，视网膜外层可见少量凋亡细胞；杞参组小鼠视网膜结构清晰，可见连续的视网膜色素上皮细胞，感光细胞核数量多于空白组，视网膜外层凋亡细胞数量少于空白组。结果见图1。

图1 各组小鼠视网膜组织细胞凋亡阳性表达（TUNEL染色，×400）

2.2 枸杞子-丹参对小鼠视网膜组织凋亡相关靶点mRNA表达的影响

与空白组、对照组、枸杞子组、丹参组比较，杞参组小鼠视网膜组织Caspase-8、Caspase-12、Caspase-3 mRNA表达降低（＜0.05）；与空白组、对照组、枸杞子组比较，杞参组小鼠视网膜组织 αB-crystallinmRNA表达升高（＜0.05）。结果见表2。

表2 各组小鼠视网膜组织Caspase-8、Caspase-12、Caspase-3和αB-crystallin mRNA表达比较（±s）

2.3 枸杞子-丹参对小鼠视网膜组织凋亡相关蛋白表达的影响

免疫组化染色显示，与空白组、对照组、枸杞子组、丹参组比较，杞参组小鼠视网膜组织Caspase-8、Caspase-12、Caspase-3蛋白表达降低，αB-crystallin蛋白表达升高，差异均有统计学意义（＜0.05）。结果见表3、图2～图5。

图2 各组小鼠视网膜组织Caspase-8阳性表达（免疫组化染色，×400）

图5 各组小鼠视网膜组织αB-crystallin阳性表达（免疫组化染色，×400）

表3 各组小鼠视网膜组织Caspase-8、Caspase-12、Caspase-3和αB-crystallin蛋白表达比较（±s，平均光密度）

免疫荧光染色显示，与空白组、对照组、枸杞子组、丹参组比较，杞参组小鼠视网膜组织Caspase-8、Caspase-12、Caspase-3蛋白表达降低（＜0.05），αB-crystallin蛋白表达升高（＜0.05）。结果见表4、图6～图9。

图6 各组小鼠视网膜组织Caspase-8阳性表达（免疫荧光染色，×400）

图9 各组小鼠视网膜组织αB-crystallin阳性表达（免疫荧光染色，×400）

表4 各组小鼠视网膜组织Caspase-8、Caspase-12、Caspase-3和αB-crystallin蛋白表达比较（±s，平均荧光强度）

图3 各组小鼠视网膜组织Caspase-12阳性表达（免疫组化染色，×400）

图4 各组小鼠视网膜组织Caspase-3阳性表达（免疫组化染色，×400）

图7 各组小鼠视网膜组织Caspase-12阳性表达（免疫荧光染色，×400）

图8 各组小鼠视网膜组织Caspase-3阳性表达（免疫荧光染色，×400）

3 讨论

凋亡是细胞程序性死亡的一种方式，多种疾病均可引起视网膜感光细胞凋亡，如黄斑变性、视网膜光损伤等。炎症因子Fas通常分布在豁免器官（眼、睾丸等），视网膜色素变性大鼠视网膜细胞中 Fas高表达，当 Fas过表达时可诱导 Caspase-8表达，Caspase-8是外源性细胞凋亡的起始位点。枸杞子味甘，性平，归肝、肾经，有补益肝肾功效；丹参味苦，性微寒，归心、肝经，有活血化瘀功效。本实验对小鼠视网膜组织Caspase-8 mRNA和蛋白表达进行检测发现，rd10小鼠视网膜组织Caspase-8 mRNA和蛋白表达较 C57小鼠升高，经枸杞子-丹参灌胃干预后，Caspase-8 mRNA和蛋白表达明显降低（＜0.05），且效果优于单用枸杞子或丹参（＜0.05），提示枸杞子-丹参可通过降低Caspase-8表达抑制视网膜感光细胞凋亡。

内质网可通过调控 Ca或激活凋亡酶诱导Caspase-12表达，活化的Caspase-12可激活Caspase-3，从而引起细胞凋亡。研究显示，Caspases抑制剂可降低视网膜凋亡细胞数量，Caspase-3抑制剂对遗传性视网膜变性疾病中视网膜光感受器细胞起保护作用，提示Caspase-3参与视网膜变性过程。内质网应激诱导的凋亡与 RP疾病进展有关。Caspase-12是内质网应激诱导凋亡的关键分子，也是组织内稳态的关键调节器。本实验检测小鼠视网膜组织Caspase-12、Caspase-3 mRNA和蛋白表达发现，rd10小鼠视网膜组织Caspase-12、Caspase-3 mRNA和蛋白表达较 C57小鼠升高（＜0.05），而枸杞子-丹参能显著抑制Caspase-12、Caspase-3 mRNA和蛋白表达，从而抑制细胞凋亡，且效果优于单用枸杞子或丹参（＜0.05）。

αB-crystallin（编码基因CRYAB）是晶状体组织中的关键蛋白，但在晶状体外的组织中也有表达，如视网膜、视神经、脑等。αB-crystallin可通过抑制Caspase-3的水解激活延缓细胞凋亡。本研究发现，枸杞子-丹参能提高rd10小鼠视网膜组织αB-crystallin mRNA和蛋白表达，抑制凋亡通路下游靶点Caspase-3激活，发挥抑制细胞凋亡的作用，且效果优于单用枸杞子或丹参（＜0.05）。

综上，本研究通过TUNEL染色、RT-qPCR、免疫组化染色和免疫荧光染色的检测方法，对 rd10小鼠视网膜组织凋亡相关靶点进行了检测。结果发现，rd10小鼠存在视网膜感光细胞凋亡，而补虚活血中药枸杞子-丹参能明显抑制rd10小鼠视网膜感光细胞凋亡，对视网膜超微结构具有保护作用，其作用机制与降低 Caspase-8、Caspase-12、Caspase-3表达，提高αB-crystallin表达有关。