天麻素注射液通过NGF/TrkA 通路减轻大鼠脑缺血所致肺损伤

脑缺血具有较高的发病率和死亡率，临床数据表明，缺血性脑损伤患者往往并发功能障碍，甚至其他器官衰竭，肺是容易受累的器官之一，且成为脑缺血性中风患者直接死亡原因之一。目前认为脑缺血后，炎性细胞活化，通过级联反应产生大量炎症介质，到达血浆中，继而使炎症反应蔓延至全身，从而引起肺损伤。因此，脑缺血致肺损伤与机体自身的免疫炎症反应有关，但具体的分子机制还不明确。目前临床对于缺血性脑卒中的治疗主要为溶栓、抗血小板、抗凝药物的应用，对于缺血后引起的肺损伤尽管有最佳的支持性治疗，但都缺乏有效的针对性治疗措施，死亡率仍高居不下。既往研究表明抑制炎症细胞因子的释放可以减轻肺损伤程度，炎症细胞因子的产生受到NF-κB激活的调节。而天麻素具有神经保护功能，对减轻缺血和再灌注损伤有积极作用，甚至可以通过抑制NF-κB的激活来减轻脂多糖诱导的急性肺损伤。然而，天麻素对脑缺血致肺损伤的治疗效果却未见报道。

神经生长因子（NGF）可以促进神经细胞的分化和生长，同时还参与免疫、内分泌和神经系统之间的相互作用。酪氨酸激酶A（TrkA）作为NGF的功能性受体，两者结合后可以使NGF 发挥大部分生物学功能。NGF/TrkA在呼吸系统中亦有表达，并且参与调节炎症性呼吸系统疾病，如哮喘、慢性阻塞性肺疾病等，甚至在炎症环境下参与肺损伤的修复过程，NGF 与TrkA 的结合可以抑制NF-κB 的活性和机体的炎症反应。因此，NGF有望成为治疗肺损伤的有效靶点，但是其在脑缺血后肺损伤及天麻素治疗过程中的作用还有待进一步明确。

本研究采用栓塞大鼠右侧大脑中动脉（MCAO）复制局灶性脑缺血模型，天麻素注射液进行治疗，观察肺组织病理改变，检测NGF/TrkA 在肺组织的表达情况，评估天麻素注射液对脑缺血致肺损伤的治疗效果，并探讨NGF/TrkA 在脑缺血致肺损伤及修复中的作用机制。

在编纂法国民法典的前夜，法学理论认为代理人与被代理人之间的关系应在委任契约中获得规范，它的内容决定了，当受委任人以委任人的名义并为他而行为之时，产生的法律效果直接由后者承受。这个结果的取得建立在意思自治的原则之上，代理人的意思与被代理人的意思成为一体。委任还与授权书联系在一起，后者被用来使得与受委任人打交道的第三人知晓其权力及其限度，因此，其行为的直接效果对委任人发生。这里也注意到了虚假代理人的活动，以及假若本人后续的追认的效果。人们还可以在委任契约中如此约定：受委任人以自己的名义行动，其行为的效果亦对他自己发生，此人随后应当将之移转给委任人。

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组

成年雄性SPF级SD大鼠40只（青龙山动物实验中心，许可证号：SCXK（京）2019-0010），体质量200±20 g。适应性饲养1周后，将40只大鼠按随机数字表随机分为正常组（Norm组）、假手术组（Sham组）、模型组（MCAO组）、天麻素治疗组（Gas组），10只/组。整个实验过程对动物的各种处理均遵照中华人民共和国科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》中有关动物的使用及伦理学规定。

专业核心课是财务管理专业的重要内容，教师通过核心课能够将财务管理知识系统的传授给学生，这样学生就会具备实际操作的能力。核心课设置如下课程：财务管理案例、财务控制、税法与筹划等，我们可以将预算管理、高级财务管理、资本运营、非营利组织财务等课程作为选修课供学生选择学习。这样也就体现了财务管理专业具备的独特性。其中，中级财务会计、财务管理、财务管理案例、财务风险管理、税法与筹划、财务控制、财务分析、成本管理会计、资产评估是专业核心课的重要内容。

1.2 主要仪器与试剂

鼻咽癌（NPC）在我国恶性肿瘤死亡疾病谱中位于14位[9]。目前国内外对鼻咽癌的治疗手段主要包括放疗、化疗、分子靶向治疗、挽救性手术治疗等[10]。其中放射性治疗被公认为鼻咽癌的首选治疗，5年生存率达80%以上[11]。局部未控或远处转移是鼻咽癌患者死亡的主要原因，困扰着医务人员及患者[12]。因此,探索精准的靶向治疗，提高NPC患者的治愈率，增加预后效果，延长远期生存期已经成为一种趋势。

1.3.5 ELISA检测 经股动脉采血，室温自然凝固后，置于4 ℃离心机中（3000 r/min）离心10 min，收集上清，严格按试剂盒说明书测定TNF-α、IL-10含量。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备 采用MCAO复制局灶性脑缺血大鼠模型，腹腔注射戊巴比妥钠（30 mg/kg）进行麻醉，仰卧位固定。在无影灯下，正中切开颈部皮肤，钝性分离各层组织，暴露右侧颈总动脉，分离至颈内动脉、颈外动脉分叉处后，用玻璃分针仔细分离迷走神经和颈总动脉，置线备用。结扎颈内动脉近心端，将栓线置入套管针，由颈内动脉插入，插入后用0号丝线结扎，将套管针取出，继续插入至颅内，插入深度约18±0.5 mm至微感阻力，使栓线头端通过大脑中动脉起始处，结扎栓线。假手术组仅分离血管不结扎，即将右颈总动脉分离至颈内动脉、颈外动脉分叉处后，用玻璃分针分离迷走神经和颈总动脉，不结扎颈内动脉。完成外科手术后，将切口缝合，将大鼠置于温度可控的条件下（24～25 ℃）以从麻醉中恢复。待大鼠完全苏醒后，观察其神经功能状态，若出现站立不稳、左侧肢体偏瘫、提尾向一侧转圈等神经功能损害症状，则为造模成功。

1.3.2 治疗方法 造模成功24 h后，参照文献［16］，Gas组用天麻素注射液10 mg/kg腹腔注射1次/d，持续14 d；Sham组和MCAO组大鼠不予治疗。

如果要评选一个最难评的奖项，文学奖应当仁不让位列其中。正所谓“文无定势”，文学本属于艺术范畴，既没有具体模板，也没有标准答案，因此才有“文无第一”之说。然而，正因为评判标准自在人心，评比程序的客观公正就显得尤为重要。唯其如此，才能使公众确信，评委秉承的是基于文学艺术的判断，而不是妥协于文学之外的“生活艺术”。

1.3.3 组织取材 治疗结束后，各组取半数大鼠腹腔注射戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉，经股动脉采血，室温自然凝固后，置于4 ℃离心机中（3000 r/min）离心10 min，收集上清，用于ELISA检测。采血后断头处死，取出全肺。左肺用以检测含水量；右肺上、中叶置于4%多聚甲醛固定液中，再进行石蜡包埋，用于HE染色；右肺下叶分装后，置于-80 ℃冰箱保存，用于Western blot检测。各组另半数大鼠麻醉仰卧固定后，经左心室先用4%多聚甲醛缓慢灌注，后用0.9%NaCl溶液快速灌注冲洗，取出全肺，将各肺叶置于4%多聚甲醛固定液中，再进行石蜡包埋，用于免疫组织化学染色。

1.3.4 肺组织湿/干比值测定 将刚取出的左肺组织表面水分吸干，称取湿重；新鲜肺组织65 ℃烘烤24 h后取出，称取干重；计算肺组织湿/干重比值。

天麻素注射液（西南药业股份有限公司），苏木精-伊红（HE）染色试剂盒、SABC 免疫组化试剂盒、SDSPAGE凝胶配制试剂盒、ANTI-NGF抗体、ANTI-TRKA抗体（武汉博士德生物工程有限公司），NF-κB p65 Ab（Affinity Biosciences），TNF alpha Ab（Affinity Biosciences），HRP-羊抗兔IgG（武汉博士德生物工程有限公司），DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），特超敏ECL化学发光试剂盒（碧云天生物技术有限公司），大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA检测试剂盒、大鼠白细胞介素10（IL-10）ELISA检测试剂盒（苏州卡尔文生物科技有限公司）。

与Norm组和Sham组相比，MCAO组大鼠肺湿/干重比值增高（<0.01），Gas组大鼠肺湿/干重比值差异无统计学意义（>0.05），而Norm组和Sham组之间的差异无统计学意义（>0.05）。与MCAO组相比，Gas组大鼠肺湿/干重比值降低（<0.05，图1）。

5．对道德的排除。由于科学技术的非政治化，使其将旧意识形态所关注的道德实践问题剔除出去，“技术统治的意识所反映的不是道德联系的颠倒和解体，而是作为生活联系的范畴——全部道德的排除。所以技术统治意识形态的核心是实践和技术的差别的消失。”［10］(P70)

1.3.7 免疫组织化学染色 固定后的肺组织经石蜡包埋后切片、脱蜡，1%triton室温孵育30 min，PBS洗涤5 min×3 次；3% HO室温孵育10 min；蒸馏水充分冲洗后PBS 浸泡5 min；枸橼酸盐缓冲液作为抗原修复液，于微波炉中热修复15 min，室温冷却后PBS 洗涤5 min×3 次；山羊血清封闭液37 ℃孵育50 min后，PBS洗涤5 min×3次；滴加一抗（NGF1∶50，TrkA 1∶100）4 ℃过夜，PBS 洗涤5 min×3 次；加二抗37 ℃孵育40 min，PBS 洗涤5 min×3 次，滴加SABC，37 ℃孵育30 min，PBS洗涤5 min×3次；DAB染色，流水充分冲洗；脱水、透明、封片。

该检修方法比较先进，能够对高压输电线路故障进行及时准确的判定，实用性和准确性兼而有之，且诊断检修效果极佳。目前，该技术已经在高压输电线路故障检修中应用非常普遍。其应用原理是通过比较分析高压输电设备在正常和异常情况下的运行情况，对设备是否发生故障及故障情况进行判断。热图谱分析法的技术优势在于结果准确、精密，实施过程简洁。检测结果对比性强，能够帮助高压输电线路检修人员对故障类型、部位、原因等进行准确判定，极具应用价值。近年来，该技术的应用范围不断拓展，电压致热设备状态检修工作中也已经将该技术作为首选。

免疫组化染色结果显示，NGF在各组大鼠肺组织中均有表达，免疫阳性细胞呈棕黄色。与Norm 组和Sham组相比，MCAO组和Gas组大鼠肺组织NGF免疫阳性细胞平均光密度值增高（<0.01），而Norm 组和Sham 组之间差异无统计学意义（>0.05）。与MCAO组相比，Gas组大鼠肺组织NGF免疫阳性细胞平均光密度值增高（<0.01，图5）。

1.4 统计学处理

用SPSS 18.0统计软件进行分析。计量资料采用均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析，两组比较采用组间最小显著性差异（LSD）检验，<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肺组织湿/干重比值变化

1.3.6 HE染色 固定后的右肺组织经石蜡包埋后切片、脱蜡、HE染色，光镜下观察各组大鼠肺组织结构的完整性，肺泡腔内的渗出情况，炎性细胞浸润程度，肺泡间隔淤血增宽情况等。

2.2 肺组织病理变化

肺组织HE染色结果显示，Norm组和Sham组肺泡结构清晰，部分区域少量微血管充血，无明显炎性细胞浸润；MCAO组肺泡结构破坏严重，肺间质淤血增宽，肺泡腔内可见红细胞和炎性细胞浸润；Gas组亦可见肺间质淤血增宽，肺泡腔内红细胞和炎性细胞浸润，但肺泡结构破坏程度较MCAO组明显减轻（图2）。

2.3 各组大鼠炎症因子含量变化

ELISA检测结果显示，与Norm组和Sham组相比，MCAO 组和Gas组大鼠TNF-α 浓度增高（<0.01）；而Norm组和Sham组之间差异无统计学意义（>0.05）；与MCAO组相比，Gas组大鼠TNF-α浓度降低（<0.01，图3）。

MCAO 线栓（北京西浓科技有限公司，型号：2432A2），石蜡切片机（Leica），电热恒温培养箱（上海三发科学仪器有限公司，型号DNP-9162），Western blot 仪器（Bio-Rad），BX51 正置显微镜（OLYMPUS），Imagepro Express C图像分析系统（OLYMPUS）。

TrkA在各组大鼠肺组织中亦均有表达，免疫阳性细胞呈棕黄色。与Norm组和Sham组相比，MCAO组（<0.05）和Gas组（<0.01）大鼠肺组织TrkA免疫阳性细胞平均光密度值增高，而Norm组和Sham组之间差异无统计学意义（>0.05）；与MCAO组相比，Gas组大鼠肺组织TrkA 免疫阳性细胞平均光密度值增加（<0.05，图5）。

2.4 各组大鼠NF-κB p65和TNF-α蛋白的表达

Western blot检测结果显示，与Norm组和Sham组相比，MCAO组和Gas组大鼠肺组织NF-κB p65和TNF-α蛋白表达增加（<0.01）；而Norm组和Sham组之间的差异无统计学意义（>0.05）；与MCAO组相比，Gas组大鼠NF-κB p65和TNF-α蛋白表达减少（<0.05，图4）。

2.5 各组大鼠NGF和TrkA免疫阳性细胞的表达比较

1.3.8 Western blot检测 预冷RIPA裂解液裂解大鼠肺组织，组织匀浆机中充分研磨后离心（12 000×，20 min），取上清液，BCA法进行蛋白定量测定。取各组样品80 μg上样，10%分离胶、5%浓缩胶进行电泳，分离蛋白质，将蛋白转移至PVDF膜上。5%脱脂牛奶常温封闭2 h，分别用含NGF、TrkA 蛋白一抗（稀释比例均为1∶1000）和GAPDH（1：1000）的TBST缓冲液孵育4 ℃过夜，TBST洗膜（10 min×3次），二抗孵育1.5 h，TBST洗膜（10 min×3次）后曝光，测定光密度值，目标条带与GAPDH光密度比值即为蛋白相对含量。

信息化技术应用是数据信息化发展的必然趋势，互联网应用、企业信息管理都是大量数据共享的成果，随着企业应用对数据的依赖性增加，数据的存储需求越来越重要，基于网络的分布式数据存储模式应用越来越多，利用HDFS的大数据文件的分布式管理功能，设计云盘系统实现用户对数据实时性、共享性的应用。

与Norm组和Sham组相比，Gas组大鼠IL-10浓度增高（<0.01），与MCAO组相比，Gas组大鼠IL-10浓度增高（<0.01），Norm组、Sham组和MCAO组之间的差异无统计学意义（>0.05，图3）。

2.6 各组大鼠NGF和TrkA蛋白的表达

Western blot 检测结果显示，与Norm组和Sham组相比，MCAO组（<0.05）和Gas组（<0.01）大鼠肺组织NGF和TrkA蛋白表达增加，而Norm组和Sham组之间差异无统计学意义（>0.05）；与MCAO组相比，Gas组大鼠肺组织NGF和TrkA蛋白表达增加（<0.05，图6）。

选取2017年2月—2018年6月90例肺癌手术患者作为研究对象，将其随机分为两组。其中，观察组男女比例为30∶15，年龄为55～81岁，平均（65.37±1.44）岁。对照组中，男女比例为31∶14，年龄为56～80岁，平均（66.41±1.32）岁。两组患者的一般资料对比，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

3 讨论

肺损伤是脑卒中患者最严重的并发症之一，导致这一并发症的机制可能有两个：一是神经源性；二是血液生成性；神经源性肺水肿与交感神经系统过度兴奋有关，从而导致肺间质水肿和肺泡间水肿伴出血。而另一种血液生成性的机制，具体的分子调节机制尚不清楚。目前认为这可能与血液中炎症级联反应有关，肺是最容易受到急性脑事件引发的炎症级联影响的器官之一。这与本实验结果一致，本研究通过MCAO法复制局灶性脑缺血模型成功后，检测大鼠肺组织湿/干重比值及HE染色，发现模型组出现了肺水肿和肺损伤，且有炎性细胞浸润。

NGF对外周神经元的存活及对神经支配、营养、神经元中神经肽合成的动态控制有非常重要的作用。研究表明NGF对脑缺血再灌注损伤后的海马神经元有保护作用。但NGF不仅存在于神经系统，在免疫细胞中亦有表达。研究表明，NGF是神经系统和免疫系统之间双向信号复杂网络中的关键分子。NGF的生物效应通过与TrkA和p75-NTR两类受体的结合来介导。TrkA对神经生长因子具有特异性，而p75-NTR是一种泛神经营养因子受体，以相等的亲和力结合所有神经营养因子，TrkA的表达被认为是引发生物反应的必要条件。本研究通过免疫组化染色法及Wstern blot检测肺组织NGF和TrkA的表达，结果显示模型组和天麻素治疗组NGF与TrkA的表达明显增加，且天麻素组较模型组增加得更加显著。以上结果均提示NGF 与TrkA的表达增加是同步进行的，因此NGF的生物学作用的发挥首先需要与其受体TrkA结合。

已有动物实验表明，NGF在自身免疫性疾病及炎症疾病中具有保护作用，在狨猴或小鼠模型中诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）后，脑室内给予NGF延迟了疾病的发作并降低了疾病的严重程度，阻止了脑损伤的充分发展。在NGF治疗的EAE动物的大脑中发现炎症浸润和脱髓鞘减少，与干扰素-γ的产生减少有关，但与IL-10的产生增加有关。另有实验通过对EAE动物给予药物治疗后，发现NGF表达水平上升，EAE动物的临床症状也有所缓解。在结肠炎动物模型中，用抗NGF抗体中和上调的NGF加重了疾病症状，浸润的中性粒细胞和巨噬细胞数量增加，肠道损伤扩大。这与本实验中天麻素治疗组的结果一致，但本实验中模型组和天麻素治疗组NGF表达均增加，天麻素组较模型组增加得更加显著，而肺组织湿/干重比值及HE染色结果显示，模型组发生严重肺水肿及肺损伤，炎性细胞浸润明显增多，而天麻素治疗组较模型组肺水肿和肺损伤程度明显减轻，炎性细胞浸润减少，提示NGF的上调对于炎症性病变的修复作用可能还涉及其他机制的参与。

TNF-α是主要的促炎细胞因子，可以刺激中性粒细胞浸润组织，并激活相关通路扩大炎症效应。IL-10可以抑制炎症反应并限制炎症引起的不必要的组织破坏，是对抗炎症的关键因子。本实验中ELISA检测结果显示，模型组炎症细胞因子TNF-α表达明显增加，抗炎细胞因子IL-10表达增加不明显，而天麻素治疗组较模型组TNF-α表达明显减少，抗炎细胞因子IL-10表达明显增加，我们推测NGF这种保护作用的发挥，不仅需要与其特异性受体TrkA结合，而且还涉及体内炎性因子的调节。NF-κB信号通路涉及多种细胞因子的介导，并作为关键转录因子参与炎症反应过程，NF-κB RelA（p65）亚基是诱导TNF-α 依赖性基因所必需的。在TLR激活的单核细胞中，NGF与TrkA的结合影响TLR信号传导，降低NF-κB 易位并抑制糖原合酶激酶3活性，从而导致炎症细胞因子的产生减少。这与本实验结果一致，本实验中模型组大鼠肺组织中NF-κB p65和TNF-α蛋白表达明显增加，而天麻素治疗组较模型组明显降低。因此NF-κB信号通路可能参与脑缺血致肺损伤大鼠体内炎症细胞因子TNF-α的调节。此外，TrkA的激活进一步增强了TLR 诱导的PI3K/Akt途径的激活，该途径是减少TLR配体诱导炎症反应的主要抗炎途径之一。TLR激活后TrkA的激活导致抗炎细胞因子的产生增加。另有体外研究表明在上皮细胞中NGF对IL-10的上调作用呈剂量依赖性，低剂量较中高剂量NGF对IL-10的上调作用更弱。结合本实验中模型组NGF/TrkA虽有增加，但IL-10的上调并不明显，因此认为，模型组NGF/TrkA的增加可能是通过低程度促进抗炎细胞因子IL-10的产生而发挥的一种代偿性保护机制，但由于NGF/TrkA增加的剂量过低，IL-10的表达量难以抵抗脑缺血后全身性炎症级联反应引起的肺损伤。而天麻素治疗组NGF进一步升高，TrkA进一步激活，促进抗炎途径激活，较高程度地抑制TNF-α、促进IL-10的产生，从而发挥保护作用。

天麻素注射液的主要成分是天麻素，天麻素是从中药材天麻中分离提取的活性成分，有研究表明天麻提取物可以调控SH-SY5Y神经细胞内NGF和BDNF等神经营养因子的表达，并对过氧化氢诱导的神经损伤有保护作用，这种保护是通过激活PI3K/Akt信号通路来实现的。天麻素还可减轻脑缺血再灌注大鼠大脑皮质损伤程度，这与调节MAPK信号通路减轻炎症反应相关；天麻素还可以通过抑制NF-κB、激活Nrf2来减轻脂多糖诱导的急性肺损伤。另外多个现代药理研究均表明天麻多糖可以提高机体免疫力。因此，结合以上资料及本实验结果，我们推测天麻素除了有助于保护脑缺血后的神经损伤，可能还通过NGF/TrkA通路激活了抗炎途径，使得炎症细胞因子TNF-α表达减少、抗炎细胞因子IL-10表达增多而对脑缺血致肺损伤起修复作用。

综上所述，本研究为探索脑缺血致肺损伤的机制及天麻素对该损伤的修复机制提供了一定基础，为临床治疗和预防缺血性脑卒中致肺损伤患者提供了一定的理论依据。但其中是否还有其他机制参与，以及与其他治疗方法相比天麻素是否具有优越性尚不清楚，也是本研究的局限性，有待进一步研究。