MicroRNA-132通过诱导线粒体氧化应激障碍-铁死亡进程促进动脉粥样硬化

动脉粥样硬化（AS）具有高发病率、高致残率及高死亡率的特点，严重影响我国国民健康，其主要的特征是动脉的慢性退化及动脉壁的逐渐变化。动脉粥样硬化的形成过程非常复杂，虽然目前与动脉粥样硬化发病机制相关的学说包括脂质浸润学说、炎症学说、氧化应激反应学说、感染学说、遗传-环境因素相互作用学说等，但仍未能完全阐明动脉粥样硬化的发病机理。

无论是放养或舍养，有抗养殖与无抗养殖氨基酸总量鸡肉中3.91%和4.08%，肝脏中32.62%和29.9%，有抗养殖略高；必需氨基酸鸡肉中0.99%和0.933 3%，两组差别不显著，肝脏中13.01%和14.81%，有抗养殖略低；非必需氨基酸肉中3.083 6%和2.968 6%，两组差别不显著，肝脏中16.952%和17.794%，有抗养殖略低，但不大；呈鲜味氨基酸中鸡肉中0.601%和0.638%，两组差别不显著，肝脏中6.44%和5.98%，有抗养殖稍高。

近年来，动脉粥样硬化的研究已由宏观转向微观，深入到效应细胞、信号转导、分子等领域。miRNA参与调节代谢等多种重要的生物学过程，在动脉粥样硬化的治疗中有潜在的应用价值。MicroRNA-132（miR-132）位于人类基因组中第17号染色体的p13.3基因间区，其的表达水平受环腺苷酸反应元件结合子的调控。成熟miR-132 是由长度为66 bp的前体序列加工而成，其序列长度为22 bp。在动脉粥样硬化发生发展中，miR-132参与内皮细胞中的脂质代谢，并可诱发细胞内活性氧（ROS）的生成等相关的促炎症过程，但具体机制尚不清楚。

铁死亡是一种新型的细胞死亡方式，已成为调控炎症相关疾病发生发展的关键机制，其主要特征为：在形态学上表现为线粒体萎缩、膜密度增加、嵴减少或消失等；在生物学上表现为铁依赖性的活性氧和脂质过氧化物的蓄积、谷胱甘肽的耗竭以及谷胱甘肽过氧化酶（GPX4）的失活等。铁死亡在内皮细胞损伤、动脉粥样硬化演进过程中起着关键的调控作用，但其具体机制仍不明确。

因此，本研究主要探索miR-132对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）生物学功能及铁死亡进程的影响，为进一步阐明miR-132在动脉粥样硬化的演进过程所起作用进奠定基础。

1 资料和方法

1.1 组织标本

收集在本单位医院行外周血管造瘘手术的动脉粥样硬化患者的斑块样本及周围正常血管样本各30例，分组为实验组（=30）与对照组（=30）。纳入标准：患者为首次接受血管造瘘手术；术前未接受任何特殊治疗；术后病理证实为动脉粥样硬化。排除标准：既往患有免疫；肿瘤以及其他感染性疾病。本研究获得了南方医科大学南方医院研究伦理委员会的批准，研究人员均自愿签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器

RNA 提取液（TRIzol，Invitgen），PrimeScript RT Master Mix试剂盒（Takara），活性氧试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒、线粒体活性氧试剂盒、线粒体膜通道转化电位试剂盒（上海凯基公司），NADH氧化还原呼吸链复合物检测试剂盒（艾美捷科技公司），线粒体探针、Image-iT®Lipid Peroxidation检测试剂盒、GPX4抗体、NOX4抗体、GAPDH抗体、鼠/兔二抗（Abcam）、流式细胞仪（BD）、激光共聚焦仪器（Olympus）。

1.3 方法

4.支持开发核心技术，保障网络安全。习近平总书记指出： “网络安全的本质在对抗，对抗的本质在攻防两端能力较量。”地方政府要统筹推动网络核心技术创新，支持本地企业、高校、科研机构等突破核心技术，加强对工业互联网、人工智能、大数据等新技术应用领域安全技术研究，构建多领域、多层次的网络核心技术体系。要积极培育壮大网络安全产品服务市场，引导通信、能源、金融、交通等重要行业、重要领域加大关键信息基础设施网络安全投入，并不断优化网络产业生态，营造有利于网络产业创新发展的地方环境，努力将核心技术牢牢掌握在自己手里，加快推进国产自主可控替代，构建安全可控的信息技术体系。

细胞线粒体的氧化还原呼吸链（复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型）活性检测结果显示：与对照组相比，上调miR-132的HUVECs 细胞内氧化还原呼吸链中复合体Ⅰ（<0.001，图4A）、复合体Ⅲ（<0.001，图4C）、复合体Ⅳ（<0.001，图4D）、复合体Ⅴ型活性显著下降（<0.001，图4E），而氧化还原呼吸链中复合体Ⅱ活性则无明显变化（>0.05，图4B）。

1.3.3 细胞内活性氧检测实验 收集成功转染的HUVECs，去除原来的细胞培养液，加入一定量的已经稀释好的DCFH-DA探针溶液。在37 ℃细胞培养箱中避光孵育20 min 后，用无血清细胞培养液洗涤细胞3次。最后，收集处理后的细胞，使用流式细胞仪检测细胞内的荧光轻度；与此同时，将处理后的细胞与线粒体红色荧光探针进行共同孵育后，用4%的多聚甲醛进行固定、以及DAPI对细胞核进行染色后，在激光共聚焦显微镜下观察细胞内的荧光强度。

取稳定生长的对数生长期的HUVECs细胞消化后接种于6孔板，密度为5×10/孔。转染前将细胞培养液更换为无双抗培养基，用miRNA negative control（Control）及目 标miRNA mimics（miR-132）分别 与Lipofectamine3000 混合后进行细胞转染，6 h后更换新鲜培养基，24 h 后收集细胞进行RT-qPCR实验评估细胞的转染效率。

1.3.5 脂质过氧化染色法 收集成功转染的HUVECs，通过Image-iT®Lipid Peroxidation检测试剂盒处理细胞，用激光共聚焦法评估细胞内的脂质过氧化状态。

现阶段专员办预算绩效监管的主攻方向在哪里？刘昆部长就强化预算绩效管理提出“五个全”的指导思想，即资金上全覆盖、预算上全方位、管理上全过程、项目上全周期、社会全监督。这为专员办强化部门预算绩效监管指明了方向。

1.3.4 线粒体功能测定实验 收集成功转染的HUVECs细胞，加入JC-1染色工作液；在细胞培养箱中孵育20 min后，吸除上清，用JC-1染色缓冲液洗涤2次，最后在流式细胞仪检测线粒体膜电位（MMP）状态。同时，将成功转染的HUVECs 细胞用线粒体活性氧（mtROS）检测试剂盒及线粒体通透性转换孔（mPTP）检测试剂盒进行处理，分别用流式细胞学及激光共聚焦法对细胞内mtROS及mPTP进行分析。最后，将成功转染的HUVECs，用线粒体复合体检测试剂盒对线粒体氧化还原呼吸链上的5个复合体的功能进行检测。

1.3.6 蛋白印迹法 收集成转转染的HUVECs，加入适量RIPA裂解液提取细胞的总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。30 μg变性总蛋白经电泳、转膜后，封闭1 h，用GPX4（1∶1000）、NOX4（1∶1000）、GAPDH（1∶1000）一抗在4 ℃孵育过夜，洗膜3 次，相应二抗（1∶3000）常温孵育1 h，洗膜3 次，ECL化学发光法显像并保存图像。

1.3.7 统计学分析 所有数据均采用IBM SPSS 20.0处理。计数资料比较则采用卡方检验。采用Kaplan-Meier法进行生存分析，并用Log-rank检验比较组间差异，以<0.05为差异有统计学意义。

在VOCs治理方面，目前工业上常用的吸附设备有固定床、移动床、流化床和转轮式吸附装置。其中固定床最常用，其结构较为简单，需要的吸附剂损失较少，但操作较麻烦，并且需要间歇操作；移动床可以连续吸附，分离能力较强，但易磨损，并且设备较大；流化床最近应用也较多，其传热面积较大、传热效果好，但结构较为复杂，吸附剂磨损严重。目前国外发达国家普遍应用转轮式吸附装置，其设备体积小、操作方便，可以连续操作，解吸出来的气体则浓度高而流量低，一般增浓比可达10～15倍；但该装置不能处理含尘废气，容易堵塞旋转轮。

2 结果

2.1 miR-132在动脉粥样硬化组织中的表达

RT-qPCR检测结果显示：相对于正常组，动脉粥样硬化组织中miR-132的表达水平较正常组织显著上调（<0.001，图1A）。

1.3.1 RT-qPCR检测 首先，从收集到的组织中提取总RNA，然后用PrimeScript RT Master Mix试剂盒将其转录为cDNA。以cDNA为模板对目的基因进行实时定量PCR反应。反应条件设置为：预变性95 ℃30 s，变性95 ℃5 s、退火65 ℃30 s及延伸95 ℃5 s，共40个循环。最后，采用2法表示目的基因的相对表达水平，以U6作为内参。

细胞内miR-132的含量检测结果显示：相比于空白对照组，阴性对照组细胞miR-132无明显变化，而实验组（miR-132）细胞内的miR-132表达水平相对于空白对照组跟阴性对照组均显著上调（<0.001，图1B）。

2.2 miR-132可促进HUVECs的ROS的产生

流式细胞学技术分析显示：相比于阴性对照组，上调miR-132 的表达能显著增加HUVECs 细胞内的ROS水平（<0.001，图2A）。通过倒置荧光显微镜观察mtROS含量与分布，结果显示：与对照组相比，miR-132上调的HUVECs细胞内内绿色荧光（ROS）显著上升，且绿色与红色（线粒体）重叠部位（黄色）显著增多（<0.001，图2B）。

2.3 miR-132可损伤HUVECs的线粒体

流式细胞学结果显示：与对照组相比，上调miR-132后能诱导HUVECs细胞的线粒体膜电位显著下降（<0.001，图3A）、细胞内的mitoROS水平明显上调（<0.001，图3B）；激光共聚焦结果显示：与对照组相比，miR-132上调的HUVECs细胞内线粒体通透性转换孔通透性明显增加（<0.001，图3C）。

重庆自贸区的成立，对我国扩大开放，深化改革，促进经济发展具有重要的理论和现实意义，同时，重庆自贸区也是我国提高创新能力，促进科技进步，推动产业结构优化转型的重要试点。健全且合理的知识产权保护是重庆自贸区健康发展的重要保障。在重庆自贸区的发展过程中，自贸区知识产权行政管理机制怎样完善、自贸区多元化知识产权纠纷解决机制怎样构建、自贸区知识产权司法保护与法律适用、自贸区海关知识产权保护以及如何构建完善的自贸区知识产权服务体系等一系列问题日益显著，重庆自贸区知识产权保护工作不仅面临新的要求和挑战，也面临一个完善重庆自贸区知识产权保护制度的重要契机。

2.4 miR-132可损伤线粒体内膜NADH氧化还原呼吸链复合物

1.3.2 细胞培养和转染 脐静脉内皮细胞（HUVECs）均使用含10%胎牛血清的DMEM培养基、置于恒温孵育箱中培养。每24 h更换1次培养基，细胞密度超过70%时，以0.25%胰酶消化进行传代培养。

教师针对课本实验，让学生思考其中的不足并要求提出改进方案，这样不仅能够激发学生的课堂参与性，使学生认真思考，更重要的是能够激活学生的思维，促进学生思维的发展.

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2.5 miR-132可促进HUVECs细胞的铁死亡进程

细胞内氧化还原状态检测结果显示：与对照组相比，上调miR-132的HUVECs细胞内的还原型蛋白被显著抑制、氧化型蛋白显著提升（<0.001，图5A、B）。同时，与对照组相比，上调miR-132的表达后，细胞氧化还原相关的蛋白GPX4显著下降、NOX4蛋白显著上升（<0.001，图5C、D）。

3 讨论

AS作为全球主要的致死性疾病。不健康的生活方式（如高脂肪食物的大量摄入、运动减少、生活压力过大等）均可导致体内脂质代谢紊乱，诱发局部炎症反应、细胞氧化应激，继而导致动脉粥样硬化的形成。

miRNAs是一种非编码RNA。目前，已在人类组织标本发现的miRNA有1000多个，其参与着50%以上哺乳动物蛋白质编码基因的调控，在疾病的发生发展中起着关键的调控作用。最新的研究证据表明，血管内皮细胞功能维持与多种miRNA的表达密切相关，包括miR-143/miR-145、miR-21、miR-31和miR-221/miR-222等。研究证实miR-132与癌症、神经元可塑性和血管生成等密切相关。然而，目前尚不清楚miR-132是否也参与动脉粥样硬化的演进。在本研究中，我们收集动脉粥样硬化患者的组织标本及血清样本进行RT-qPCR 分析，结果显示动脉粥样硬化组织中miR-132的表达较正常组织显著上调。此外，我们还成功通过构建过表达miR-132的HUVECs模型，进一步对其细胞内氧化应激状态、线粒体功能及铁死亡关键蛋白等进行分析，阐明miR-132在动脉粥样硬化的演进中的关键调控作用。

细胞和组织中ROS的生成和清除之间的不平衡被称为氧化应激，而机体内ROS的动态平衡对机体具有重要影响。既往研究发现，ROS有利于胶原沉积和血管平滑肌细胞增殖，最终导致动脉粥样硬化斑块发展。本研究深入分析miR-132对内皮细胞的调控作用，结果显示上调内皮细胞中miR-132的表达水平后，能导致细胞内活性氧水平异显著升高，但其如何调控动脉粥样硬化尚不清楚。

铁死亡是一种由于细胞氧化应激损伤所致的、铁依赖的新型死亡方式。铁死亡与很多疾病的发生发展密切相关，如肝炎、急性肾衰及急性心衰等。铁死亡在动脉粥样硬化的发生发展中发挥着重要作用。例如PTGS2通过诱导内皮细胞铁死亡促进动脉粥样硬化的发生和发展。抑制小鼠内皮细胞的铁死亡可以抑制动脉粥样硬化的发生发。上调血管平滑肌细胞中GPX4的表达可有效阻断氧化应激、增强对动脉的保护、延缓动脉粥样硬化的发生。在本研究中，我们也进一步证实上调细胞内miR-132的表达可以影响细胞氧化应激状态，从而抑制CPX4的表达、促进HUVECs铁死亡的发生。

综上所述，在动脉粥样硬化的演进过程中，miR-132处于高表达状态，并引起内皮细胞中ROS的异常升高，进而引起线粒体功能障碍，如线粒体膜电位改变，线粒体ROS升高，线粒体膜通道开放等，进一步导致细胞内GPX4蛋白降低以及氧化酶NOX4蛋白上升、诱导铁死亡发生，最终促进动脉粥样硬化的演进。本研究阐明了miR-132在动脉粥样硬化发生发展中的调控作用及机制，miR-132 有望成为动脉粥样硬化诊疗的关键标志物。