树突棘及突触发育障碍诱发自闭症小鼠核心症状的机制

自闭症（ASD）是一种先天性疾病，其病因与大脑中枢神经系统发育障碍密切相关。ASD核心症状有兴趣狭窄、重复刻板行为以及社会交往交流障碍。在中国6～12岁的儿童中，ASD患病率约为0.7%。

前额叶皮层（PFC）是信息处理、记忆控制、情感认知和情绪调控的中心。PFC异常与ASD核心症状的发生密切相关。产前VPA 暴露的啮齿动物常被用于ASD模型的研究。

树突棘是兴奋性突触的传递位点，能够接收信息并形成突触联系，被认为是突触可塑性的基础。研究报道，VPA诱导的ASD小鼠PFC树突棘总密度降低，但不同类型树突棘密度的变化及其具体的调控机制，目前尚不清楚。研究发现，在单一全身性癫痫发作的大鼠模型中，树突棘的变化与PI3K/Akt/mTOR信号通路过度激活相关。在VPA诱导的ASD模型小鼠中，PFC树突棘发育障碍是否与PI3K/Akt/mTOR信号通路的变化相关，目前尚未见文献报道。突触后密度蛋白95（PSD95）和突触素（Syn）与突触可塑性相关，Syn缺失的小鼠会出现ASD样表型。基于此，我们通过改良方式建立VPA诱导的ASD小鼠模型，探讨PI3K/Akt/mTOR信号通路及PSD95、Syn异常，是否导致小鼠PFC树突棘及突触发育障碍，并诱发小鼠出现ASD样表型。

1 材料和方法

1.1 药物与试剂

丙戊酸钠（VPA），DMSO（Sigma）；明胶（BioFroxx）；OCT组织包埋剂（Sakura Finetek）；高尔基染色试剂盒（Hitobiotec）；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（康为）；脱脂奶粉（博士德）；山羊抗兔IgG（碧云天），PVDF膜和ECL化学发光试剂盒（Millipore）；Wortmannin，p-PI3K，PI3K，AKT，p-mTOR，mTOR，PSD95 和Syn 抗体（CST）；p-Syn 抗体（Abcam）；p-Syn抗体（Bioss）；β-actin抗体，p-AKT（Affinity）。

统计结果显示，零零后高职新生总体状况良好，总分正常的人数为1 509人，占比64%，总分中等以上的比例为96.4%。总分为极高和较高的人数为85人，占比为3.6%。差异性分析结果显示人格特质和社会支持得分在性别上差异显著。总分及各分测验得分状况见表1。

1.2 实验动物

将小鼠过量麻醉处死，取完整脑组织。将小鼠脑组织浸泡在5倍体积的高尔基溶液1、2的混合液中，室温避光放置。静置12～24 h后，更换等量混合液，室温避光放置。静置14 d后，更换等量溶液3并且避光放入4 ℃冰箱。静置12 h 后，再次更换等量溶液3，4 ℃避光放置。静置48～72 h，用滤纸吸干多余溶液，将脑组织置于-80 ℃保存。冰冻切片机切片，厚度为100 μm，晾干后进行高尔基染色处理。

1.3 动物模型建立及分组

成年C57小鼠按雄鼠：雌鼠=1∶2的比例合笼过夜，次日8～9点，查看合笼雌鼠受精情况。若肉眼见阴栓，阴道涂片见精子，则该雌鼠视为受精成功，当天记录为孕0.5 d。将孕鼠随机分为2组，于孕10 d、12 d分别注射0.9%的生理盐水或VPA，其子代雄鼠分别作为CON组（10只），VPA组（10只），VPA+DMSO组（10只）和VPA+Wortmannin（10只）。其中CON组和VPA组不做处理；VPA+Wortmannin组小鼠脑立体定位注射0.1 mmol/L Wortmannin；VPA+DMSO组小鼠脑立体定位注射等量5%DMSO作溶剂对照。

1.4 脑立体定位注射

将5周龄VPA小鼠进行脑立体定位注射。小鼠吸入式麻醉，脑立体定位仪固定，去除毛发，碘伏消毒皮肤，做中线切口，3%过氧化氢清洁颅骨，以Bregma为原点，根据小鼠脑立体定位图谱确定PFC坐标（AP=-2.68，ML=±1.0，DV=-1.5），颅骨钻暴露脑组织，微量注射器注射DMSO溶液或Wortmannin溶液，单侧单次剂量为1 μL，药物注射速度为0.1 μL/min。注射完成后，清洁消毒，缝合皮肤，术后保温。

1.5 行为学测试

2.1.1 旷场实验 与CON组相比，VPA组小鼠自我捋毛时间增加（<0.001），跨中央格减少（<0.05）。与VPA组相比，Wortmannin组小鼠自我捋毛时间减少（<0.05），跨中央格增加（<0.05）。表明VPA组小鼠具有ASD样重复刻板行为和焦虑行为，Wortmannin能改善ASD小鼠重复刻板行为和焦虑行为。4组小鼠跨总格数、直立和攀墙次数均无统计学差异（0.05），各组小鼠运动功能良好，对陌生环境的垂直探索能力无明显差异（图1）。

将麻醉后的小鼠依次灌注0.9%生理盐水和4%多聚甲醛，取脑组织，蔗糖梯度脱水。冰冻切片机切片，厚度为15 μm。PBS 漂洗3 次，5 min/次，0.3%Triton X-100破膜1 h，PBS漂洗3次，5 min/次，羊血清封闭37 ℃孵育1 h，分别加入一抗PSD95（1：500，CST），p-Syn（1∶300，Bioss），4 ℃孵育过夜。次日，PBS 漂洗3 次，5 min/次，分别避光加入荧光二抗驴抗兔555（1∶200），羊抗兔488（1∶300），37 ℃孵育30 min，PBS漂洗3次，5 min/次。加入DPAI，室温孵育5 min，抗荧光衰减封片液封片，激光共聚焦显微镜观察。

1.5.3 三箱社交实验 实验装置为亚克力玻璃，长120 cm，宽20 cm，高22 cm，装置左右两腔各放置一个空笼子：（1）适应阶段：放入受检测小鼠自由运动10 min；（2）社交互动测试阶段：将左腔的空笼子里放入一只陌生小鼠1（Stanger 1）。重新放入受检测小鼠，并记录10 min内受检测小鼠停留在各个箱体的时长，与Stanger 1的交流时长，与空笼子（Object）的接触时长；（3）社交偏好测试阶段，将右腔的空笼子放入另一只陌生小鼠2（Stanger 2）。重新放入受试小鼠，并记录10 min内受试小鼠的社交偏好情况。

4组小鼠树突棘分类示意图（图4A）。与CON组相比，VPA组小鼠PFC树突棘总密度（<0.01），成熟型蘑菇状（<0.001）和粗短状（<0.05）树突棘密度均减少；不成熟型丝状树突棘密度增加（<0.01）。与VPA组相比，Wortmannin组小鼠PFC树突棘总密度（<0.01），成熟型蘑菇状（<0.001）树突棘密度均增加；不成熟型丝状树突棘密度减少（<0.01，图4B～E）。

1.6 高尔基染色

本次实验所用的C57BL/6J小鼠，均购于重庆医科大学实验动物中心，合格证号为SYXG（渝）2018-0003。饲养环境相对湿度约为55%，温度约为23 ℃，环境安静，遵循昼夜节律，小鼠能够自由饮食饮水。本研究涉及到的动物实验，均通过了重庆市科学技术委员会的伦理审查。

1.7 Western blot检测

将麻醉后小鼠灌注0.9%生理盐水，取脑组织分离PFC。称重，加入蛋白酶抑制剂和RIPA 裂解液，研磨PFC组织，静置、离心、收集上清液并进行蛋白浓度的测定。将蛋白样品浓度进行标准化，热变性，冻存于-20 ℃备用。将配平的蛋白质样品进行恒压电泳，恒流电转于PVDF 膜，使用5%的脱脂奶粉溶液封闭，加入对应抗体，4 ℃孵育过夜。次日，TBST漂洗3次，10 min/次，加入二抗，37 ℃孵育1 h，TBST漂洗3次，10 min/次，进行化学发光以及曝光。

1.8 免疫荧光染色

1.5.2 青年玩耍实验 实验装置为亚克力玻璃，长60 cm，宽60 cm，高40 cm，装置内有1 cm 厚垫料：（1）适应阶段：放入受检测小鼠自由运动10 min；（2）测试阶段：重新放入该小鼠和一只陌生互动小鼠（以下行为学实验过程中所用的陌生鼠，均为与受检测小鼠同龄同性别异笼饲养的C57小鼠）。记录受检测小鼠10 min内的挖掘时长，与陌生小鼠的互动时长。

采用直升导管法在泥浆中浇筑混凝土防渗墙，并配备3台专用的自制悬臂式导管提升架，导管布置和整个混凝土浇筑施工过程必须严格按照设计要求和相关规范规定一次性完成。

1.9 统计学处理

2.1.2 青年玩耍实验 与CON组相比，VPA组小鼠社交时间减少（<0.001）。与VPA组相比，Wortmannin组小鼠社交时间增加（<0.05，图2B）。表明VPA组小鼠社交互动能力下降，Wortmannin能改善ASD小鼠社交缺陷。四组小鼠挖掘时间均无统计学差异（0.05，图2C），表明四组小鼠对陌生环境的探索能力无明显差异。

2 结果

2.1 ASD样行为学检测

1.5.1 旷场实验 实验装置为亚克力玻璃，长60 cm，宽60 cm，高40 cm。装置底部按比例划分为16个等大的方格，中间4个方格视为中央格，周围12个方格视为周围格：（1）适应阶段：放入受检测小鼠自由运动10 min；（2）测试阶段：重新放入该小鼠，记录该小鼠在10 min内的捋毛时长、跨中央格次数、跨总格次数、攀墙次数、站立次数。

此外，魏金枝还参与了理发业工人的罢工运动。1921年5月，杭州280多家理发店的1000队名理发工人，为反对资本家的剥削和压迫，举行了联合罢工，时间一星期，魏金枝和浙江一师的其他师生一起，应工人们的要求，协助起草请愿书，并参加向省政府请愿的活动。最后罢工取得了胜利，资本家被迫增加工资，改善工人待遇。毋庸置疑，在“五四”运动期间，魏金枝是以满腔的热情投入到了工人运动中，为浙江工人运动做出了自己的贡献。

使用GraphPad Prim 8.0软件进行数据处理绘图，多组数据比较采用单因素方差分析（one-wayANOVA），计量数据采用均数±标准误表示，<0.05表明差异具有统计学意义。

2.1.3 三箱社交实验社交测试 与CON组相比，VPA组小鼠在A箱停留时间减少（0.01），在B箱停留时间增加（0.05），与陌生鼠1交流时间减少（0.01），与物体接触时间增加（0.01），VPA组小鼠社交互动能力下降。与VPA组相比，Wortmannin组小鼠在B箱停留时间减少（0.05），与物体接触时间减少（0.05，图3C），表明Wortmannin能改善ASD小鼠社交互动缺陷。三箱社交实验社交偏好测试阶段中，与CON组相比，VPA组小鼠与陌生鼠1交流时间增加（0.05）。与VPA组相比，Wortmannin组小鼠与陌生鼠1交流时间减少（0.05，图3D）。VPA组小鼠喜欢与熟悉事物接触，不喜欢与新鲜事物接触，即社交偏好能力障碍，Wortmannin能改善ASD小鼠社交偏好障碍。

2.2 小鼠PFC树突棘发育情况

以碳酸盐为主的矿床主要包含钙质碳酸盐型矿床和镁质碳酸盐型矿床，一般矿物成分为方解石、石灰石和白云石等，同时还含有黏土矿物。这类矿床的地质成因一般为热液碳酸盐型、胶体沉积型和生物化学沉积碳酸盐型的矿床。在我国广西、湖南和广东三省碳酸盐岩地区，金属硫化物矿山经选别排出的尾矿分为四类：(1)方解石型尾矿, 如车河和黄沙坪选矿厂排出的尾矿 ;(2)白云石型尾矿, 如泗顶和古丹选矿厂排出的尾矿;(3)白云石-方解石混合型尾矿,如凡口选矿厂排出的尾矿;(4)铁白云石型尾矿, 如老厂选矿厂排出的尾矿[12]。

第四，在林政资源管理过程中要构建一支高素质、强能力的复合型队伍，相关部门要充分发挥自身的管理作用，对现有的林政资源管理人员加以培训教育，如讲座、进修、考核等，确保相关人员在专业化角度提高自身的造林、护林、用林的水平，实现真正意义上的生态建设。

2.3 小鼠PFC中PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达情况

与CON组相比，VPA组小鼠PFC中p-PI3K（<0.001），p-AKT（<0.05）和p-mTOR表达均升高（<0.001）。与VPA组相比，Wortmannin组小鼠p-PI3K（<0.05），p-AKT（<0.01）和p-mTOR表达均降低（<0.01，图5B～D）。

本文针对我国农村电网实际情况，提出加大农村电网实际检查力度的策略。该种策略主要从以下两方面进行分析。第一方面，提升农村电网的改造力度，对线损情况进行全面化的检查，进而健全农村电网的规划。由于现阶段的农村电网依旧处于线损情况较为严重，且农村电网处于有待建设以及有待规划的情况中。故而应对农村电网的线损情况进行全面化的检查，并对农村电网进行规划，加强改造力度[5]。第二方面，加强偏远地区的电网线损检测以及线路规划。由于我国某一部分的偏远农村地区电网规划尚未完善，存在供电半径长以及电网负荷情况较大的问题。故而应实施加强偏远地区的电网线损检测以及线路规划的策略，进而改善农村电网线损处于较为严重的情况。

2.4 小鼠PFC中突触相关蛋白表达情况

与CON 组相比，VPA 组小鼠PFC 中PSD95（<0.01）和p-Syn表达均降低（<0.001）。与VPA组相比，Wortmannin 组小鼠PFC 中PSD95（<0.05）和p-Syn I表达均升高（<0.01，图6B、C）。与CON组相比，VPA组小鼠PSD95与p-Syn荧光强度减弱，与VPA组相比，Wortmannin 组小鼠PSD95 与p-Syn 荧光强度增强（图6D、E）。

3 讨论

ASD具有高度的异质性，由于致病原因的多样性，其发病机制尚不明确，目前关注较多的一点为：神经元树突棘和突触发育异常。儿童2～3岁时，大脑树突棘数目达到高峰。在大脑发育早期，树突棘生成和修剪异常可能导致突触结构和功能的改变，从而引起ASD的发生。已有文献报道，ASD患儿大脑树突棘存在过度的形成和/或不完全修剪。经研究发现，VPA诱导的ASD小鼠PFC总树突棘、成熟型蘑菇状和粗短状树突棘密度降低，未成熟型丝状树突棘密度增加。那么在该模型中，树突棘发育异常的具体机制又是什么呢？PI3K/AKT/mTOR信号通路能够调节突触的强度、活性和成熟度以及轴突再生。铝通过PI3K/AKT/mTOR信号通路会诱导大鼠海马CA1区树突棘密度减少，引起突触可塑性损伤，造成大鼠脑功能损伤。在癫痫模型中，PI3K/AKT/mTOR信号通路的过度激活会导致未成熟型树突棘密度显著增加，诱发认知障碍及记忆障碍。在VPA诱导的ASD模型小鼠中，PFC树突棘密度的异常变化是否与PI3K/Akt/mTOR信号通路相关？基于此，我们发现VPA诱导的ASD模型小鼠PFC中，PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白过度激活可能导致总的、成熟型树突棘密度显著降低，未成熟树突棘密度增加。运用PI3K抑制剂Wortmannin后，能够抑制该信号通路，改善树突棘发育，改善小鼠ASD样表型。

PSD95是突触后密度的组成成分，与突触可塑性密切相关。PSD95的异常被认为是ASD等精神疾病神经发育障碍的原因之一。Syn是神经元磷酸化蛋白家族，由三个不同的基因编码，即SYN I、SYN II 和SYN III。Syn一方面能够调节囊泡的内吞和胞吐，参与神经递质的释放；另一方面能够调节突触可塑性，包括突触的发生、稳定和传递。目前，在ASD的家系中已经发现了Syn基因的突变，并且该基因异常可能导致突触稳态失调。有研究报道，Syn的缺失或功能性突变可能引起神经元发育受损，并导致小鼠出现ASD样表型。我们在VPA诱导的ASD模型小鼠中发现，PSD95 和p-Syn 蛋白表达水平显著降低，运用Wortmannin后，PSD95和p-Syn蛋白表达水平升高。

因此，我们认为，PI3K/AKT/mTOR信号通路的过度激活和突触相关蛋白PSD95、p-Syn 表达降低可能导致VPA诱导的ASD小鼠PFC树突棘损伤和突触发育障碍，最终引起ASD样表型的出现。