虎杖苷减轻大鼠创伤性颅脑损伤后的肠损伤：基于激活Sirt1介导的SOD2和HMGB1去乙酰化抑制氧化应激和炎症反应

由严重创伤引起的创伤性脑损伤（TBI）是导致死亡和残疾的主要原因，已成为全球公共卫生问题。TBI 以头部的原发性穿透性或非穿透性损伤为特征，它不是孤立事件，而是与许多非神经损伤相关的生物学过程，例如涉及胃肠系统的全身炎症和器官功能障碍。这些通常在最初的大脑机械损伤后数分钟到数月发生，并在很大程度上导致发病率和死亡率。肠黏膜是内部环境与外部环境相互作用的最大表层。肠上皮将管腔内容物隔开，防止病原抗原侵入。脑损伤后，肠上皮细胞功能障碍或凋亡可能由于缺血和/或缺氧、氧化应激和炎症反应而发生，继而肠粘膜的通透性增加。TBI诱导的肠道通透性可引起肠道内毒素和细菌的移位，进一步诱发或加重全身炎症反应，导致多器官功能衰竭和死亡。维持肠黏膜结构的完整性，保护肠屏障功能可以改善TBI的预后。因此，寻找兼具抗氧化和抗炎效应的药物可能是治疗TBI后肠损伤的有效途径。

虎杖苷（PD）作为中国传统中药虎杖的根茎提取物，具有对抗氧化应激及炎性损伤的生物学效应。最近，有研究表明虎杖苷可以减轻TBI的继发性脑损伤和急性肺损伤。然而，虎杖苷在TBI后的肠道保护作用和机制尚不清楚。有临床研究表明补充虎杖苷可以有效缓解肠易激综合征患者的临床症状，改善肠道功能；虎杖苷在烧伤及脓毒症引起的肠道损伤中被证实具有减少促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α的释放，降低氧化应激反应，减轻肠粘膜损伤的作用。我们既往研究表明，虎杖苷可能通过激活Sirt1继而去乙酰化超氧化物歧化酶（SOD）2和高迁移率族蛋白B1（HMGB1）分别在失血性休克肠损伤和肾损伤发挥作用。上述研究回顾，提示虎杖苷可能通过肠道氧化应激水平和炎症反应发挥减轻TBI的作用。本文旨在探讨虎杖苷对创伤性颅脑损伤继发性肠粘膜损伤的保护效应及其潜在机制，为TBI后肠损伤的药物治疗提供潜在选择。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物SPF级雄性SD大鼠，体质量220～300 g，购自南方医科大学实验动物中心，所有动物的安置和饲养依照《南方医科大学实验动物管理办法（试行）》进行，动物实验符合南方医科大学实验动物伦理委员会制定的动物实验标准，许可证号：SCXK（粤）2016-0041。在动物房饲养1～2周适应环境后进行试验。取25只大鼠随机分假手术组（Sham 组）及TBI后12、24、48 和72 h组，5只/组，在对应时间点处死大鼠。另取15只大鼠随机分为假手术组、脑创伤+生理盐水组（TBI+NS组）和脑创伤+虎杖苷治疗组（PD组），5只/组，48 h后处死大鼠后进行脑组织和肠道组织取材。

1.1.2 试剂与仪器 液压颅脑损伤仪器（Model01-B，NEWSUN），动物脑立体定向仪（瑞沃德，深圳），正置显微镜（Nikon，ECLIPSE FNI），酶标仪（Thermo ScientificMultiskanFC），Image-Pro Plus 6.0图像分析系统，虎杖苷（深圳海王药业有限公司），TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（Roche），甲苯胺蓝染料（北京索莱宝科技有限公司），逆转录和PCR 试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司），D-乳酸（D-LAC）检测试剂盒（Biovision），二胺氧化酶（DAO）检测试剂盒（南京建成科技有限公司），脂质过氧化物（LPO）检测试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司），活性氧（ROS）检测试剂盒（上海贝博生物科技有限公司），免疫沉淀试剂盒和BCA蛋白定量检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），Sirt1 Activity Assay Kit（Abcam）。

1.2 方法

1.2.1 TBI模型建立及各组干预措施 大鼠经异氟醚吸入麻醉后，将其固定于脑立体定向仪上，逐层分离骨膜并暴露颅骨。在大鼠冠状缝后5 mm，矢状缝左侧3 mm处，手动以4 mm直径脑壳钻头钻出骨窗并夹出骨片，保证硬脑膜完整。用502胶将连接管与骨窗平面连接，以义齿基托树脂进行加固并测试管道密闭性，待大鼠出现掐尾反射后则进行液压损伤打击，本实验造成的损伤程度为3±0.2 atm峰值冲击压力，为重度颅脑损伤模型，打击后TBI大鼠会出现短暂性的呼吸暂停，常需立即给予预防性的人工胸部按压。假手术组仅做手术操作不进行液压冲击，TBI时间梯度组为进行液压冲击，造模成功后在相应时间点一并称量Sham组和TBI组大鼠的体质量，并取粪便计算粪便含水量；TBI+NS组在损伤后30 min于腹腔注射等量生理盐水，PD组在液压冲击损伤后30 min于腹腔注射虎杖苷（30 mg/kg，溶于0.5 mL生理盐水中，剂量参考）。

与假手术组相比，TBI 后大鼠空肠组织IL-1β 和TNF-α的mRNA相对表达均明显增高（<0.05），但IL-6的mRNA表达无差异（0.0517，图3A）；TBI后大鼠促炎因子蛋白表达水平均显著升高（<0.01）。虎杖苷处理后显著降低了IL-1β和TNF-α的mRNA水平（<0.05，图3A），但IL-6的mRNA表达水平无差异（0.1294）；虎杖苷也降低了TBI大鼠空肠组织的促炎因子IL-6、IL-1β蛋白表达量（<0.01），TNF-α有下降趋势但差异无统计学意义（=0.0867，图3E）。

与假手术组大鼠相比，TBI 48 h大鼠脑组织形态结构发生变化，可见明显的脑挫裂伤（图1A）；病理结果显示脑膜不连续，皮层出现明显的神经元坏死和凋亡（图1B），且在48 h最为明显；TBI组大鼠在24 h和48 h体质量逐步下降，72 h后部分恢复（均<0.001，图1C）；TBI大鼠粪便含水量在前48 h呈下降趋势，72 h下降尤为明显（=0.0094，图1D）；TBI大鼠血清DAO 水平在12 h开始明显增加（<0.001），D-LAC 水平在24 h 增加明显（=0.0085）两者随时间增加其表达水平逐渐升高，48 h最为明显（均<0.001，图1E、F）。

1.2.4 血清D-乳酸和二胺氧化酶检测 标本收集前尾静脉取血，静置4 h，3000 r/min 4 ℃离心15 min，收集上清液，-80 ℃保存。比色法检测血清中D-LAC和DAO的含量，操作步骤严格按照试剂盒操作说明书完成。

1.2.3 标本收集 各组大鼠经异氟醚麻醉后，尾静脉采血，开胸暴露心脏，100 mL生理盐水溶液快速灌注冲洗全身循环血液，灌注完成后，断头取脑并置于4%多聚甲醛中固定，取约4～6 cm空肠组织清洗干净，除去脂肪和肠系膜，置于-80 ℃保存，另取4～6 cm空肠清洗干净后于4%多聚甲醛固定。

近年来，因火灾引起的车辆事故时有发生，按照起火原因，汽车火灾大致分为自燃、引燃、碰撞起火、爆炸和雷击五种类型，这五种类型的前三项，成为了司法鉴定的重点。本文结合一起实际案例，利用激光拉曼光谱法对现场残留物进行成分分析，使用“排除法”确证了现场起火的根本原因。保险公司的理赔工作提供了法律依据。[1-3]

1.2.5 组织活性氧和脂质过氧化物检测 将新鲜的空肠组织取出后用微量电子天平称重后置入4 ℃PBS中制作10%（组织重量∶PBS=1∶9）的组织匀浆，12 0004 ℃离心15 min，取上清液进行检测。采用二氯荧光素乙酰乙酸盐（DCFH-DA）荧光分光光度法检测ROS，采用比色法检测LPO 水平，检测步骤严格按试剂盒说明书进行。

与假手术组相比，TBI 组大鼠空肠组织ROS 和LPO 生成明显增加而SOD2 蛋白水平降低（均<0.001）；PD处理后TBI大鼠空肠组织SOD2蛋白表达量显著提高（=0.0079），ROS 和LPO 水平显著降低（<0.001，图3H、I）。

1.2.8 肠道组织病理 取空肠组织标本按常规脱水、透明、包埋，石蜡切片4 μm，按组别进行苏木素-伊红染色（HE染色），在光学显微镜下观察肠粘膜受损情况并进行肠道粘膜损伤评价。参照方法评估大鼠肠粘膜黏膜萎缩、坏死以及出血，中性粒细胞浸润，黏膜层结构完整情况。将染色后的各组大鼠空肠切片置于10倍镜下随机视野观察，测量肠切片5根最长肠绒毛及所对应的隐窝深度和绒毛宽度，最后进行拍照保存。

1.2.7 脑组织甲苯胺蓝和TUNEL染色 经4%多聚甲醛固定48 h后的脑组织常规石蜡包埋，切片厚度为4 μm。脱蜡后的切片置于1%甲苯胺蓝水溶液中染色，经分化、脱水、透明、封片等操作后于显微镜下观察尼氏小体；石蜡切片经脱蜡至水后根据TUNEL 试剂盒说明经0.1%Triton-X通透、3%BSA封闭、显色、干燥、封片后于显微镜下观察凋亡神经细胞。

1.2.9 空肠组织IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA水平的测定新鲜的空肠组织各称取20 mg，用TRIzol试剂提取空肠组织总RNA，检测RNA水平和浓度。使用反转录试剂盒将500 ng总RNA逆转录为cDNA，后采用荧光定量检测试剂盒（SYBR Green）进行实时荧光定量PCR 反应。将IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA的相对表达水平标准化为β-actin表达，采用2方法计算mRNA表达的相对倍数变化。实时定量PCR引物通过和美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库设计，引物序列如下：TNF-α（正向：5'-GTG GAA CTG GCA GAA GAG GC-3'，反向：5'-AGA CAG AAG AGC GTG GTG GC-3'）；IL-1β（正向：5'-CTG TGT CTT TCC CGT GGA CC-3'，反向：5'-CAG CTC ATA TGG GTC CGA CA-3'）；IL-6（正向：5'-TTC CAT CCA GTT GCC TTC TT-3'，反向：5'-CAG AAT TGC CAT TGC ACA AC-3'）；β-actin（正向：5'-TGCTGTCCCTGTATGCCTCTG-3'，反 向：5'-TGATGTCACGCACGATTTCC-3'）。同一样本重复3次，反应条件为95 ℃10 s；95 ℃10 s，60 ℃30 s，共40个循环；溶解曲线反应条件为95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s。

1.2.10 免疫沉淀 从-80 ℃冰箱中取出各组大鼠空肠组织，称取30 mg组织，加入500 μL含蛋白酶抑制剂的IP专用裂解液，将组织提取物蛋白与抗体孵育过夜，以使溶液中的蛋白质-抗体相互作用，然后与蛋白A/G偶联的琼脂糖珠孵育4 h，使用缓冲液洗涤珠子后用蛋白质印迹法检测蛋白乙酰化水平。

1.2.11 蛋白印迹法 从-80 ℃冰箱中取出各组大鼠空肠组织，称取100 mg组织，用蛋白提取试剂盒提取组织蛋白，使用BCA法测定蛋白含量。煮沸8 min使蛋白质变性，上样电泳。首先调节电压80 V，电泳30 min，随后升高电压至120 V，电泳120 min，湿法转至0.45 μm PVDF膜，5%BSA 于室温封闭1 h，分别加入兔抗claudin-5（AF5216，AFFINITY，1∶1000）、ZO-1（AF5145，AFFINITY，1∶1000）、SOD2（A19576，ABclonal，1∶1000）、TNF-α（AF7014，AFFINITY，1∶1000）、IL-6（DF6087，AFFINITY，1∶1000）、IL-1β（YT2322，IMMUNOWAY，1∶1000）、HMGB1（orb195321，Biorbyt，1∶5000）、Acetyl-HMGB1-K29（A16002，ABclonal，1∶1000）、Acetyl-SOD2-K68（ab137037，Abcam，1∶1000）、β-actin（AF7018，AFFINITY，1∶10000），4 ℃过夜孵育16 h，TBST洗膜，加入山羊抗兔二抗（稀释度1∶10000），室温孵育1 h后，TBST洗膜、ECL显色、暗室曝光观察，采用Image J软件分析。

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1.3 统计学方法

使用SPSS26.0软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析。当<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TBI加重大鼠肠损伤

1.2.2 体质量变化和粪便含水量测定 大鼠经干预处理后，观察大鼠一般情况。将大鼠放在笼中自由进食和饮水，按照分组记录各组大鼠的体质量变化。收集粪便颗粒进行称重（m），然后将粪便颗粒在烤箱中干燥后再次称重（m），计算粪便含水量，粪便含水量=（m-m）/m×100%。

2.2 虎杖苷减轻TBI大鼠肠损伤

与TBI组相比，虎杖苷治疗组部分恢复了TBI后大鼠的体质量，48 h 尤为明显（<0.001），同时也增加了TBI大鼠粪便含水量（=0.0147，图2A、B）。此外，虎杖苷显著降低了TBI 后48 h 大鼠血清的D-LAC（=0.0116）和DAO水平（=0.0048）。Western blot测定空肠组织中ZO-1和claudin-5蛋白含量。与假手术组相比，TBI组空肠组织紧密连接蛋白ZO-1和claudin-5蛋白表达量显著降低；虎杖苷部分恢复了TBI后大鼠空肠组织ZO-1（=0.0056）和claudin-5（=0.0156）的含量。肠组织病理方面，假手术组的大鼠空肠黏膜结果基本正常，绒毛和上皮细胞结构完整、排列整齐，无炎性细胞浸润。与假手术组相比，TBI组空肠黏膜部分区域坏死结构不连续，绒毛脱失明显，高度明显降低，排列紊乱或出现断裂；虎杖苷导致TBI大鼠空肠组织坏死减少，结构相对连续，绒毛脱落减少，高度增加，排列趋向整齐（图2 I）。不仅如此，绒毛高度及与隐窝深度的比值得到显著提高（<0.001，表1），但隐窝深度未见明显增加（=0.083，表1）。

应用SPSS 15.0统计学软件进行数据分析，[n（%）]表示计数资料，行 χ2检验，（±s）表示计量资料，行 t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.3 虎杖苷降低TBI大鼠空肠组织的促炎细胞因子水平和氧化应激水平

本文研究结果显示,观察组切口感染率为3.57%,对照组为21.43%,观察组切口感染率低于对照组。观察组患者护理满意度为94.64%,对照组为78.57%,观察组护理满意度高于对照组,说明在骨科切口感染中融入手术室护理干预,有助于降低患者切口感染发生率,提升患者护理满意度[4]。

案例的难易要恰当，也就是说既不能太难，防止分析问题无从入手，使学生失去学习的兴趣和动力；也不能过于简单，否则无法充分进行分析讨论，不能有效激发学生学习的积极性。只有案例难度适中，才能够充分调动学生积极地进行辩论，并通过论证来选取最优的问题解决方案，培养学生多方面能力[17]。

1.2.6 Sirt1活性测定 新鲜空肠组织取出称重后匀浆反应于500 μL免疫沉淀缓冲液中提取蛋白，取上清加入含有荧光肽段溶液和蛋白琼脂糖珠的混合物进行反应，使用酶标仪进行荧光定量（激发光340 nm，发射光460 nm），以1～2 min间隔的荧光强度测量NAD依赖性脱乙酰酶活性，酶活性的最终表现形式为相对于Sham组的吸光度比率，检测步骤严格按试剂盒说明书进行。

2.4 虎杖苷能够激活大鼠空肠组织的Sirt1活性并降低SOD2和HMGB1的乙酰化水平

与假手术组相比，TBI后空肠组织Sirt1活性降低（=0.0135），SOD2和HMGB1乙酰化水平升高（<0.001）；但给予虎杖苷处理后Sirt1 活性恢复（=0.0011），HMGB1和SOD2乙酰化水平降低（均<0.001）。

3 讨论

本研究证实TBI大鼠肠道屏障功能受损，氧化应激和促炎细胞因子水平增加；而虎杖苷治疗能够减轻TBI后的肠损伤，其机制可能和上调去乙酰化酶Sirt1介导的氧化应激反应和促炎细胞炎症因子释放的抑制有关。据我们所知，这项研究首次明确了虎杖苷在TBI后肠道保护的作用和提出了可能的保护机制。

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严重创伤性颅脑损伤患者中，胃肠功能障碍常见。由于缺血缺氧、氧化应激、炎症反应等，肠粘膜屏障功能受损，内毒素和肠道菌群移位入血，激活机体免疫细胞，增加了TBI患者的死亡率。D-乳酸和肠黏膜上皮细胞分泌的二胺氧化酶（DAO）在肠道通透性增高时可以发生肠道移位，其水平可用于评估肠道损伤严重程度和肠上皮细胞屏障功能。紧密连接是肠上皮细胞维持肠道屏障功能的主要连接方式，其中ZO-1 和claudin-5是构成紧密连接的主要骨架蛋白，其表达量的变化反映了肠粘膜结构的完整性。本研究中TBI大鼠血清D-乳酸、DAO水平升高，空肠ZO-1、claudin-5蛋白表达水平下降，与既往研究结果一致，本研究证实了TBI后出现了肠道粘膜损伤。

本研究探讨了虎杖苷作为新药在TBI后肠道保护作用和可能机制。虎杖苷是一种传统中药虎杖的提取物，具有抗炎、抗氧化、抗休克、改善微循环等药理学作用。在溃疡性结肠炎中，PD可以降低MPO表达、脂质过氧化物水平从而减轻氧化应激损伤；此外，PD也可通过促进核因子E2相关因子2（Nrf2）的核转录，增加血红素加氧酶-1（HO-1）的表达，在DSS诱导的结肠炎中发挥抗氧化作用。我们既往研究表明虎杖苷可以通过激活沉默信息调节因子1（SIRT1）和SIRT3减轻失血性休克对于肠损伤的打击，其机制可能和去乙酰化SOD2有关。我们的这项研究关注了TBI对于肠道损伤的影响，和既往研究一致，研究结果发现TBI大鼠空肠组织氧化应激水平相关因子（ROS、LPO）明显增加而抗氧化因子SOD2表达下降，证实TBI后肠道存在显著的氧化应激损伤。此外，研究发现加入虎杖苷治疗后，空肠组织ROS、LPO蛋白表达水平降低，SOD2含量增加，反映虎杖苷可以抑制TBI后肠道脂质过氧化反应从而减轻肠道氧化应激损伤。具体的机制而言，虎杖苷部分上调了SOD2的蛋白水平，但我们推测虎杖苷上调SOD2的蛋白水平是间接的，其分子机制部分来源于去乙酰化SOD2继而增加SOD2的活性发挥了有效的抗氧化应激作用，这在我们的实验结果中得到了证实。另一方面，虎杖苷通过保护线粒体发挥作用，而线粒体的破坏也是ROS过度释放的来源。综合而言，虎杖苷在TBI 后的肠损伤保护作用可能是基于去乙酰化SOD2和保护线粒体继而减少氧化应激发挥作用的。

创伤性脑损伤（TBI）的管理需要了解影响周围器官的继发性后遗症，包括胃肠道（GI）。脑-肠轴由双向途径组成，TBI引起的神经炎症和神经变性通过这些途径影响肠道功能，由此产生了TBI诱导的粘膜通透性增加。继发性肠道炎症的存在延长了系统性炎症，加重了TBI。因此，抗炎是一个有希望的针对TBI 的治疗方向。既往研究表明虎杖苷通过抑制炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6的产生，减轻炎症性肠病及创伤性休克引起的肠道损伤，保持肠道上皮的完整性。TBI后肠道损伤后的氧化应激损伤往往伴有炎症反应，过量的自由基堆积可以引起促炎细胞因子的分泌，IL-6、IL-1β和TNF-α的水平会迅速升高，同时也会破坏肠道上皮屏障。另有研究表明，虎杖苷通过减少小胶质细胞炎症，从而减轻创伤性脊髓损伤。本研究结果发现TBI后大鼠空肠组织促炎因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）释放显著增加，证实TBI后肠道存在显著炎症损伤；而在加入虎杖苷治疗后，空肠组织L-6、IL-1β、TNF-α mRNA和蛋白表达水平降低，提示虎杖苷可以抑制TBI后肠道过度的炎症反应，从而减轻肠道受损，这在既往是未见报道的。此外，本研究证实了虎杖苷能够降低HMGB1的乙酰化水平，这可能是虎杖苷直接抑制炎症反应的直接分子机制。本研究为PD应用于TBI的治疗提供了实验依据和理论基础。

本实验存在一定的局限性。首先，我们未采用敲基因动物和更多化学抑制剂或激动剂探讨具体的上下游分子机制；其次，本实验也未检测TBI后免疫功能和多个器官损伤情况，TBI后对于全身器官的免疫可能也造成了损伤，我们尚没有开展这方面的研究；此外，TBI对于肠损伤的影响绝非脑-肠之间的氧化应激和炎症两个方面影响的，其他的器官损伤也参与了其中，另外肠道微生物菌群的结构和数量改变，代谢产物的变化也参与了TBI 后肠损伤。这些都将是我们以后研究的重点方向。

浮盘导静电装置，浮盘上的导静电装置对浮盘安全运行十分重要，在浮盘运行中需要一年不少于2次检测，一般春季、秋季各一次，要求接地电阻<10Ω为合格，否则必须采取有效措施予以防控。静电导出装置，应采用不锈钢钢丝绳，其截面积不得小于φ2mm。当罐径≤21m时，每台铝(钢)制内浮顶设置不少于2根；当储罐径>21m时，每台设置不少于3根。静电导出所采用钢丝绳的两端采用不锈钢鼻子与铝(不锈钢)制内浮顶和储罐罐体连接。

综上所述，虎杖苷可减轻TBI对大鼠肠粘膜的损伤，其机制和激活Sirt1，去乙酰化SOD2和HMGB1，减轻氧化应激损伤和促炎因子的释放有关。