CCN5在子宫内膜异位症患者组织的表达及其作用机制

子宫内膜异位症（EMS）简称内异症，是一种功能性子宫内膜上皮组织以及腺体组织出现在宫腔以外部位的疾病。内异症在育龄女性中的发病率约为10%，其中有30%～50%的内异症患者会出现疼痛（痛经、慢性盆腔痛等）与不孕的症状，给患者带来巨大的生理与心理压力，是危害育龄女性身心健康的重要疾病。由于内异症的发生机制十分复杂，至今尚未彻底阐明，导致临床针对内异症的治疗手段有限。因此，进一步深入研究影响内异症发生与进展的分子及其作用机制具有重要的意义。

既往研究表明，内异症患者异位病灶内膜组织来源细胞与正常在位内膜组织来源细胞之间存在显著差异。子宫内膜基质细胞作为内膜组织最主要的细胞组成之一，其功能的异常与内异症的发生密切相关。有研究显示，异位病灶来源子宫内膜基质细胞的增殖、迁移与侵袭能力与正常子宫内膜的基质细胞相比显著增强。既往研究显示，异位病灶中内膜基质细胞功能的改变受到病灶微环境的调控，异位内膜中异常表达的生长因子EGF以及长链非编码RNA均参与内异症内膜基质细胞侵袭能力的调控。然而，异位病灶微环境中调控内异症内膜基质细胞功能改变的分子网络十分复杂，亟待进一步研究。

我又请学生看文章的第9自然段：“整整十三年零五个月过去了……满园的创伤使我的心仿佛又给放在油锅里熬煎。”然后问学生这一段中“满园的创伤”表现在哪里，从而引导学生体会原来是非常美好的一个院子，现在变成了“无缝的墙”，这里的墙不仅指的是实体的墙，还指人与人之间关系的隔膜。“文革”不只是对经济的破坏，也是对人精神的戕害，这种灾难不仅是经济的衰败，是社会的衰败，更是人心的衰败。所以，这“满园的创伤”不仅是说这个小环境的改变，更是为了表明大环境的改变，这也正是巴金写这篇文章及《随想录》的真正背景。

近年来，研究发现CCN蛋白家族在众多生理过程与病理过程中均发挥关键作用。CCN5是CCN蛋白家族的重要组成之一，其在细胞增殖、肿瘤的侵袭与转移过程中发挥关键作用。既往有研究表明CCN5参与子宫肌瘤进展的调控，提示CCN5在女性生殖系统疾病中可能发挥重要作用。鉴于内异症内膜基质细胞在增殖、迁移及侵袭上表现出类似肿瘤细胞的特性，是否CCN5在其中发挥调控作用未见相关报道。因此，本文将通过比较卵巢内异症组织与正常在位内膜中CCN5的表达水平，研究过表达或敲低CCN5对子宫内膜基质细胞增殖、迁移、侵袭及上皮-间充质转化的影响，初步揭示CCN5对子宫内膜基质细胞功能的调控作用及其机制，以期为今后临床干预内异症异位病灶侵袭提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 20例卵巢子宫内膜异位症标本取自2020年1月～2020年4月在南方医科大学南方医院妇产科住院并行腹腔镜手术患者（年龄23～37 岁，平均年龄=30.70±3.72岁），患者月经周期规律，标本均经过术后病理证实为子宫内膜异位症组织。15例正常对照在位内膜组织取自南方医科大学南方医院妇产科生殖中心因男方因素行IVF-ET助孕治疗的女性（年龄22～34岁，平均年龄=28.20±3.02岁），排除子宫内膜异位症的诊断，月经周期规律。卵巢子宫内膜异位症患者排除术前3月应用促性激素释放激素激动剂（GnRHa）或其它激素类药物。排除患有多囊卵巢综合征以及其他原因导致的慢性无排卵患者；排除患有输卵管积水的患者；排除患有慢性疾病（如糖尿病、其他内分泌疾病、心血管疾病、血脂异常）患者；排除患有系统性红斑狼疮以及其他风湿疾病的患者；排除HIV以及其他活动性感染的患者。本研究经南方医科大学南方医院伦理委员会批准，符合伦理学标准（NFEC-2017-055）；所有受试对象均由专业人员详细告知研究内容并自愿参加，同时签署知情同意书。

1.1.2 细胞株 腺病毒人子宫内膜基质细胞由厦门大学王海滨教授馈赠。腺病毒（吉玛生物），genOFF h-CCN5、对照siRNA片段（广州锐博生物公司）。

RT-qPCR 方法检测CCN5 在20 例实验组卵巢子宫内膜异位组织与15 例正常对照组在位内膜中的mRNA表达水平。RT-qPCR实验结果显示，实验组中的表达水平较对照组显著降低（图1A，<0.01）；进一步采用Western blot 检测CCN5 在卵巢子宫内膜异位组织及对照组在体内膜中的蛋白水平，研究结果同样显示，CCN5在实验组中的表达水平显著降低（图1B，<0.01）。

1.2 方法

采用腺病毒转染构建CCN5 过表达的HESCs 细胞，RT-qPCR 与Western blot 方法检测腺病毒转染HESCs中CCN5基因和蛋白的表达水平。实验结果显示：腺病毒转染后的HESCs中CCN5基因的表达水平显著升高（图2A，<0.01）；Western blot实验进一步证实腺病毒转染后HESCs中CCN5蛋白表达水平也显著升高（图2B，<0.01）。证实腺病毒在HESCs中转染成功并过表达CCN5基因。CCK8实验检测过表达CCN5基因对HESCs增殖的影响，结果显示：过表达CCN5可以抑制HESCs增殖能力（图2C，<0.01）。划痕实验观察过表达CCN5 基因对HESCs 迁移的影响，结果表明：HESCs 中过表达CCN5 后，其细胞迁移能力受到明显抑制，在24 h 时间点处差异存在统计学意义（图2D，<0.01）。Transwell小室侵袭实验观察过表达CCN5基因对HESCs侵袭的影响，结果显示HESCs中过表达CCN5后，HESCs的细胞侵袭能力显著降低（图2E，<0.01）。Western blot 方法检测CCN5 过表达的HESCs与对照组EMT 相关标记物的表达水平，结果显示：CCN5过表达后HESCs中上皮细胞标记物E-cadherin表达显著升高，间充质细胞标记物N-cadherin、Snail 以及Vimentin的表达降低（图3D，<0.01）。

在研究CCN5过表达对HESCs体外生物学影响的实验中，载有CCN5编码基因的慢病毒感染细胞为实验组，缩写为CCN5组，对照组为空载体慢病毒感染细胞，缩写Vecor组；在探究沉默CCN5的实验中，转染针对CCN5的siRNA片段组为实验组，缩写为si-CCN5组，转染无意序列的siRNA片段为对照组，缩写si-Control组。每次进行统计分析的实验都设3复孔，且重复3次；所得数据采用SPSS22.0软件分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用两独立样本检验，多组间计量资料比较采用单因素方差分析。<0.05表示差异具有统计学意义。

EMT过程与内异症异位细胞迁移、侵袭过程密切相关，我们采用Western blot实验检测过表达CCN5对HESCs细胞EMT经典标记物表达水平的影响。过表达CCN5 的HESCs 中，EMT 过程中上皮细胞标记物Ecadherin的表达水平显著升高，而N-cadheirn、Snail-1以及Vimentin的表达水平显著降低，结果差异具有统计学意义（<0.01，图3A、B）。

1.2.6 Western blot实验 细胞总蛋白提取采用全蛋白提取试剂盒，按照试剂盒的说明书提取细胞蛋白；蛋白定量采用BCA蛋白定量试剂盒，按试剂盒说明书操作。

由于水库碾压混凝土浇筑量较大，因此以自卸汽车入仓方式为佳。在本项目中，所有的碾压混凝土均通过自卸汽车的方式完成入仓。在入仓前，为保持浇筑面清洁，避免杂质干扰，应对汽车表面进行充分的清洁，配备长达100m的脱水路段，此外还应建有路面排水沟，防止污水流入仓内。

1.2.4 Transwell小室检测细胞侵袭能力 预先铺好基质胶，取Ad-CCN5，vector，si-CCN5，si-Control组细胞，用无血清培养基分别重悬5×10个不同处理组细胞接种在小室上层；下室中加入700 μL全培，放置于37 ℃、5%CO培养箱中进行培养。每处理组分别设置3个复孔。培养36 h后取出小室，吸取小室培养基，用棉签轻柔擦拭小室内面，然后结晶紫染色15 min，轻柔洗涤后再显微镜下进行计数。

图5是动态实验前后泡沫铝试件的对比图，可见泡沫铝在直接冲击下，冲击端的直径会略微有所膨胀，但是由于实验中试件尺寸略小于输入杆的直径，故而动能均以轴向变形消耗为主，横向效应可以忽略不计。冲击端呈现压溃的情形，而冲击波未到达的区域并未发生明显变形。需要说明的是试件撞击之前的直径略小于输出杆的直径，撞击过程中的微小膨胀依然是在输入杆的容许范围内，故而认为输入杆测量的应力数据是真实可靠的。

1.2.5 划痕实验检测细胞迁移能力 取不同处理后的HESCs细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，使用全培重悬细胞，接种5×10细胞在6孔板中，置于37 ℃、5%CO的培养箱中进行孵育培养。细胞会合成90%左右时，换液并采用丝裂霉素处理1 h。用已消毒的10 μL微量移液头在6孔板上垂直划过，PBS洗涤3次，加入无血清培养基，0 h、24 h时间点分别在倒置显微镜下观察细胞情况并拍照。

1.2.3 细胞增殖能力检测 利用CCK-8实验检测CCN5对HESCs 增值能力的影响。将经过不同处理后的HESCs消化、计数，铺板于96孔板，每孔接种约1×10细胞。然后放置于37 ℃、5%CO浓度培养箱6 h；接下来在0 h时间点孔加入10 μL CCK-8溶液，放置于培养箱继续孵育1.5 h，用酶标仪测定；接下来在24 h、48 h培养时间点重复上述操作，用酶标仪测定相关时间点孔的。

3．在具体问题上，与日本一样，中国对明治文学大家夏目漱石、森鸥外的关注度都很高。不同的是，中国对日本政治小说(截至2018年8月，搜索日本JAIRO可得33件，CINII160件，中国知网573件)和《不如归》(日本JAIRO可得12件，CINII66件，中国知网51件)的研究在数量上超过日本，尤其是政治小说。这隐约可见中国文以载道的传统文学观的影响，而对《不如归》的关注，很大原因在于该小说的甲午战争背景。

1.2.7 RT-qPCR实验 按照RNA提取试剂盒的说明书提取HESCs细胞的总RNA，并对提取出的RNA进行浓度测定，标记好存放于-80 ℃保存。依据Takara逆转录试剂盒说明书合成cDNA，采用SYBR Green法作为实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）的扩增和定量的方式，按Takara的产品说明书执行操作。以GAPDH作为内参，采用2计算目的基因的相对表达量。

1.3 实验分组与统计学方法

1.2.2 腺病毒与小干扰RNA转染 取处于对数生长期的HESCs铺板培养（24孔板，5×10/孔）检测病毒滴度。确定好腺病毒滴度后，培养HESCs至40%左右密度，添加Polybrene穿孔素（4 μL/500 μL培养基），根据测得的腺病毒滴度处理HESCs，处理6～8 h后更换为无血清无双抗无酚红DMEM培养基。针对CCN5的小分子干扰RNA（siRNA）以及对照siRNA 均采用Lipofectamine 3000脂质体转染系统，操作均按照试剂说明书操作。

实验按照一位数加一位数、一位数加两位数、一位数加三位数……依次进行．主试以每隔0.8~1秒读一个数字的速度进行口述，被试在一组中回答正确题目达到3，则该组测试完成，进入下一组测试；若在一组测试中答对正确题数未能达到3，则认为未能完成该组测试，测试结束．将被试在所完成的最后一组测试中，测试题加数和被加数的位数之和，作为被试不进位加法的口算广度．而对每组中3次正确测试的时间（以秒为单位）进行计算，将均值和标准差，作为被试在每组的口算速度．每套口算测试题测试结束后，测试对象有3分钟的休息时间，再进行下一套测试．

2 结果

2.1 CCN5在卵巢子宫内膜异位症组织中的表达情况

1.1.3 主要实验试剂 无酚红DMEM 高糖培养基（DMEM/F12，Thermo），碳吸附胎牛血清（CS-FBS，PAN），丙酮酸钠（Sigma），胰岛素-转铁蛋白-硒（Gibco），嘌呤霉素（Sigma），碳酸氢钠、葡萄糖（索莱宝）；Lipofectamine 2000（Invitrogen），Western blot相关实验试剂以及细胞裂解液（Thermo），RNA 提取试剂盒（Takara），RT-PCR 试剂盒和SYBR GreenⅠ（TaKaRa）；鼠抗人CCN5、E-cadherin、N-cadherin、Snail-1、Vimentin 和β-actin 抗体（CST）；PVDF 膜和化学发光HRP 底物（Millipore）；胰蛋白酶和羊抗鼠二抗（Proteintech）；引物由广州锐博生物公司设计及购买。

2.2 过表达CCN5对HESCs的增殖、迁移和侵袭能力的影响

1.2.1 细胞培养HESC细胞的培养体系是 10%碳吸附胎牛血清+1%青霉素/链霉素、3.1 g/L葡萄糖+1 mmol/L丙酮酸钠+1.5 g/L碳酸氢钠+1%胰岛素-转铁蛋白-硒+500 ng/mL嘌呤霉素，在37 ℃、5%CO的细胞培养箱中培养。细胞生长至70%左右时，采用0.25%的胰蛋白酶进行消化传代及继续培养。

2.3 过表达CCN5对HESCs中EMT标记物表达的影响

近年来，在国家教育部门发布的中明确要求，对职业教育领域探索混合所有制提出了明确的要求。在校企共建产业学院时，在产权配置结构上，应尽量吸纳不同股东进行多方面入股：随着混合所有制实践在职业教育领域的不断推进，相关制度不断完善，逐步承认混合所有制二级产业学院法人地位，必将会使得校企共建产业学院模式向外推广，得到重视，极大程度改善政府办学经费投入不足的问题。

2.4 敲低HESCs中CCN5对HESCs的增殖、迁移和侵袭能力的影响

为了进一步确定CCN5对HESCs细胞功能的调控作用，利用si-RNA 技术敲低HESCs中CCN5的表达，并用RT-qPCR技术检测si-CCN5的效率。结果显示：转染si-CCN5的HESCs中CCN5基因的表达水平较对照组显著降低（图4A，<0.01）。采用Western blot方法检测转染si-CCN5后HESCs细胞中CCN5蛋白的表达水平，结果显示CCN5蛋白的表达水平较对照组显著降低，证明转染si-CCN5成功且发挥敲低HESCs中CCN5蛋白表达的作用（图4B，<0.01）。我们采用CCK-8实验检测si-CCN5敲低HESCs中CCN5表达后的细胞增殖能力，并与si-Control组HESC细胞的细胞增殖能力进行比较，实验结果显示：敲低CCN5后HESCs的细胞增殖能力较si-Control组显著增强，差异具有统计学意义（图4C，<0.01）。划痕实验观察敲低CCN5后对HESCs细胞迁移能力的影响，结果发现在24 h时间点si-CCN5组HESCs细胞迁移能力较si-Control组显著增强，差异具有统计学意义（图4D，<0.01）。我们采用Transwell小室实验检测敲低CCN5后HESCs细胞的侵袭能力，结果显示HESCs细胞侵袭的能力较si-Control组显著增强（图4E，<0.01）。

2.5 敲低CCN5对HESCs中EMT标记物表达的影响

采用Western blot 方法检测敲低CCN5 后HESCs细胞中EMT经典标记物E-cadherin、N-cadherin、Snail-1及Vimentin 的表达情况，实验结果显示：与si-Control组相比较，si-CCN5 组中HESCs 上皮细胞标记物Ecadherin表达显著降低，间充质细胞标记物N-cadherin、Snail-1及Vimentin的表达显著升高（图5A、B，<0.01）。

3 讨论

子宫内膜异位症是一种具有恶性行为的良性妇科疾病，药物和手术治疗后易复发，严重影响育龄期妇女的生殖健康，常导致女性不孕症的发生。子宫内膜异位症异位病灶子宫内膜基质细胞迁移、侵袭能力增强，与子宫内膜异位症的发生发展密切相关，然而调控异位子宫内膜基质细胞迁移和侵袭能力的机制仍未完全阐明。本次研究发现卵巢子宫内膜异位病灶中CCN5的表达显著降低，过表达人子宫内膜基质细胞中的CCN5可以显著抑制人子宫内膜基质细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并且抑制人子宫内膜基质细胞的EMT转化；相反，敲低人子宫内膜基质细胞中的CCN5表达后，子宫内膜基质细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著提高，促进子宫内膜基质细胞的EMT转化。以上结果提示，CCN5可能通过影响细胞EMT，影响人子宫内膜基质细胞的迁移、侵袭能力，在子宫内膜异位症的发生发展中发挥作用。

CCN5是CCN家族蛋白中的一员，其作为肿瘤抑制基因一直倍受关注。过表达乳腺癌细胞中的CCN5后可以显著抑制乳腺癌细胞的增殖与侵袭能力；CCN5在抑制口腔癌细胞增殖与侵袭过程中发挥重要作用，它不仅参与肿瘤的增殖、侵袭和转移过程，并在纤维化疾病的发生、发展中也发挥关键作用。CCN5在人体子宫组织中也有表达并参与子宫平滑肌细胞增殖的调控，过表达CCN5后可以抑制子宫肌瘤的进展。鉴于子宫内膜异位症的发生、发展与异位内膜具有肿瘤细胞的特性密切相关，且已证实CCN5可调控肿瘤组织细胞的生物学特性，那么CCN5是否在异位子宫内膜中组织中表达且其对子宫内膜基质细胞的增殖、迁移与侵袭能力等特性有何影响，相关研究报道至今未见。为此，本研究收集并检测卵巢子宫内膜异位症组织与正常在位子宫内膜组织中CCN5的表达情况，结果证实CCN5在卵巢子宫内膜异位症组织中的表达水平显著低于正常在位子宫内膜组织，提示CCN5可能参与卵巢子宫内膜异位症的发生与发展。

CCN5在肿瘤细胞的生物学功能调控中发挥重要作用，是否也同样参与子宫内膜基质细胞功能的调控？本研究通过腺病毒转染HESCs 过表达CCN5 后，HESCs细胞活性和增殖能力被显著抑制；其细胞迁移与侵袭能力也受到明显抑制。反之，si-RNA 敲低HESCs中CCN5表达后，其增殖能力明显增强，细胞迁移与侵袭能力也显著上调。上述实验结果表明，CCN5在HESCs的增殖、迁移和侵袭功能调控过程中发挥重要作用，提示CCN5可能作为一个潜在干预靶点在抑制内异症异位病灶的侵袭与进展中具有一定的价值，值得进一步研究。

EMT是指上皮细胞原有的上皮极性和细胞间连接逐渐消失，同时细胞的迁移和侵袭能力显著增强。体外研究发现，子宫内膜基质细胞EMT增强后，可以显著提高基质细胞迁移与侵袭的能力。进一步研究显示子宫内膜异位症病灶中内膜上皮细胞与基质细胞均发生明显的EMT转化，导致异位内膜细胞迁移与侵袭能力显著增强，促进内异症的发生与发展，由此可见EMT在子宫内膜异位症发病过程中发挥重要作用，是介导异位组织HESCs细胞迁移、侵袭能力显著增强的重要机制。参与调控内异症内膜基质细胞发生EMT的机制十分复杂，既往研究发现EMS患者异位病灶升高的hsa_circ_0008433通过促进基质细胞的EMT进而增强异位组织的侵袭能力；LncRNA-CDKN2B-AS1在EMS患者异位病灶中的表达升高，且过表达HESCs中CDKN2B-AS1 可以显著促进HESCs 发生EMT转化。然而是否在EMS 异位病灶中表达显著降低的CCN5也参与内膜基质细胞EMT转化的调控尚未见相关报道。本研究发现在过表达CCN5后，HESCs中与间质细胞相关的标记物N-cadherin，Snail-1 和Vimentin的表达水平显著低于对照组，与上皮细胞相关的标记物E-cadherin的表达水平明显升高，提示过表达CCN5可以显著抑制HESCs 的EMT；相反，当敲低CCN5 表达后，HESCs 中与间质细胞相关的标记物N-cadherin，Snail-1和Vimentin的表达水平显著升高，与上皮细胞相关的标记物E-cadherin 的表达水平明显降低，表明CCN5 表达水平的降低可以显著促进HESCs 发生EMT。以上实验结果说明CCN5的表达可影响子宫内膜基质细胞EMT相关标记分子的表达，进而参与子宫内膜基质细胞EMT的调控，介导子宫内膜基质细胞迁移与侵袭能力的调控。

大源园林生态园是诸城市工商资本参与林业发展的一个缩影。今年，诸城市发挥财政资金引导作用，撬动工商资本参与林业发展，推动农村产业振兴、生态振兴。今年财政已投入6100万元，吸引50多家工商企业投资林业项目，带动社会资本5.7亿元。华欣铸造、金盛园地产、大源园林、万兴集团、东方园艺等企业建设特色经济林园区，新种植榛子、矮化苹果、大樱桃、优质板栗、核桃等1.5万亩，带动2万农户发展经济林。

综上，本研究结果表明卵巢子宫内膜异位症组织中CCN5的表达水平显著降低，并发现CCN5可以调控子宫内膜基质细胞的增殖及抑制其迁移侵袭的能力，并影响内膜基质细胞的EMT转化，提示CCN5异常降低可能是参与子宫内膜异位症发生与发展的重要机制之一，CCN5可能有望成为干预子宫内膜异位症异位病灶侵袭与进展的潜在靶标，值得进一步深入研究。