RFWD2调控小鼠大脑皮层神经元树突发育及树突棘形成的功能效应

环指和色氨酸-天冬氨酸重复序列结构域2（RFWD2），属于COP-DET-FUS 家族成员，是一类E3泛素连接酶。在哺乳动物细胞中，内源性RFWD2主要以复合物形式存在于细胞核质和核膜中，少数存在于细胞质中，通过其卷曲螺旋区域形成二聚体发挥作用。RFWD2在多种肿瘤中异常高表达，可调节细胞增殖、分化及凋亡，以及DNA损伤修复。

RFWD2是哺乳动物中各种底物的关键负调节因子，包括p53、激活蛋白-1（AP-1）和c-Jun、p27（Kip1）、ETS转录因子的Pea3亚家族、转录因子CCAAT/增强子结合蛋白α、转移相关蛋白（MTA1）、乙酰辅酶A 羧化酶、叉头框蛋白O1（FoxO1）和转录共激活因子2。神经干细胞中缺失RFWD2的小鼠在发育中的脑和脊髓中显示ETV1、ETV4、ETV5和c-Jun表达异常升高，促进了神经组细胞向胶质细胞分化。AP-1转录因子c-Jun广泛表达于发育中的大脑，对神经发生至关重要。RFWD2可通过调控底物蛋白FoxO1表达，调节神经元形态、突触发生和海马的神经发生，且与焦虑和重度抑郁症的发展相关。小鼠纯合子RFWD2缺失（RFWD2）可导致E9.5～E12.5之间的胚胎致死，且大脑皮层、海马和小脑明显发育异常。因此，RFWD2参与的泛素-蛋白酶体系统对于调控哺乳动物脑的正常发育、神经元轴突生长与突触发育都是至关重要的。

进水渠长45.0m，底宽18.7m，矩形断面。进水口前2.5m为厂前水平段，高程为106.41m；总长45m采用坡度为1∶3的反坡段连接至121.4m高程。

树突棘密度、形状和大小异常与神经精神疾病密切相关，而维持突触的功能和完整性取决于及时将无用或多余的蛋白质降解，蛋白质降解的失调将导致神经精神疾病的发生。我们推断RFWD2可能是突触蛋白内稳态的一个关键调控因子，在控制调控神经元树突发育、树突棘形成与突触蛋白稳态中发挥关键作用，但其具体作用机制仍不清楚。本研究通过分析RFWD2在小鼠大脑皮层神经元中的定位及分布，探讨其表达水平对神经元树突发育及树突棘形成的功能效应及作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

健康Balb/c雌雄实验小鼠均购自安徽医科大学实验动物中心，清洁级动物房中饲养，环境温度控制在26 ℃，取自胎龄16 d小鼠大脑皮层进行体外神经元培养。实验动物的使用和实验程序均经蚌埠医学院实验动物管理和伦理委员会（IACUC）批准（编号：

[35]宁德市政协文史资料：《闽东文史资料——闽东名人故居》第六辑，温州：温州大草原印业有限公司，2008年，第189页。

1.2 主要试剂

DMEM/F12 培养基、Neurobasal 培养基（Gibco），鼠抗RFWD2、兔抗Synaptophysin（SYN）、鸡抗Map2、兔抗ETV5、Myc tag抗体（Abcam），兔抗PSD95（CST），驴抗兔Cy3（Jackson Lab），兔抗ETV1、ETV4、c-Jun抗体（Bioss），驴抗鼠Alexa Fluor 488、驴抗鸡Alexa Fluor 633、ToPro3、抗荧光淬灭封片剂（Invitrogen）。

1.3 RFWD2在小鼠全脑的表达谱

RFWD2-shRNA能够显著降低内源性RFWD2表达，并显著提高神经元突触蛋白的形成与数量（图4A、B），SYN斑点数量由17.2±2.4/10 μm增至19.6±2.6/10 μm（<0.05）；而PSD95 斑点数量由8.5±1.3/10 μm 增至11.5±1.1/10 μm（<0.05，图4C）。

马克思在批判继承前人的基础上，开创了以经济特性把握市民社会的传统。 马克思眼中的市民社会是在生产力发展到一定阶段，以社会组织为形式，以商业生活和工业生活为内容，体现人们的物质交往关系并独立于政治国家。 他汲取了黑格尔国家和市民社会关系中的合理成分后得出：市民社会决定国家，只有对市民社会进行深入的观察和剖析，才能解决整个社会问题。 马克思说“法的关系正像国家的形式一样……相反，他们根源于物质生活关系，这些物质生活关系的总和，称之为‘市民社会’，而对市民社会的解剖应该到政治经济学中去寻找”[3]66。 因而，马克思开始在政治经济学中深入地研究市民社会。

1.4 RFWD2在不同发育时期小鼠大脑表达变化

提取小鼠胚胎14 d（Embryo14，E14），出生后（Postnatal，P0、P14、P21、P30、P60、P105）不同发育时期大脑皮层总蛋白，经Bcinchoninic acid（BCA）蛋白定量试剂盒定量后，每孔40 mg蛋白上样SDS-PAGE电泳，电转膜至PVDF 膜（0.45 μm），通过Western blot 检测RFWD2与突触囊泡蛋白（SYN）的相关性表达。

1.5 RFWD2在大脑皮层神经元中的表达与定位

农田排水沟渠是由植物、土壤/底泥、微生物所组成的半自然生态系统，可以通过植物截留、吸收、生物降解等一系列作用，降低排放到水体中的污染物含量。生态型排水沟渠，既可保持原有的排水功能，又可增强对农田排水所携带的氮磷去除效果。本研究基于多孔透水的沟道护砌材料、垫层材料、沟道植被生态系统、控制排水等方面，在试验示范区构建完整的农田径流生态渗滤沟道系统。

1.6 RFWD2在大脑皮层神经元树突发育与树突棘形成中的功能效应

取E16 胎鼠大脑皮层，制备神经元细胞悬液2×10/mL，使用Lonza 2B细胞核电转染系统对过表达与抑制表达质粒进行电转染，电转染程序为Rat Hippo（neuron）O-003。过表达载体为pCMV-RFWD2-Myc（美国Luis A.Martinez 博士惠赠）和载体FUGW-GFP（4∶1比例）的混合物，抑制表达载体为RFWD2表达绿色荧光蛋白（GFP）特异性shRNA，pGPU6/GFP/Neo-RFWD2-shRNA（前期验证有效），转染的神经元通过GFP鉴定，体外培养至14～21 d，使用共聚焦显微镜检测GFP阳性树突分支，树突棘密度、形状和大小，Image J软件进行Sholl分析。

1.7 RFWD2影响大脑皮层神经元功能的分子机制

分别提取RFWD2过表达、抑制表达与对照组大脑皮层神经元总蛋白，通过Western blot 检测确定RFWD2下游各种底物的关键负调节因子（Pea3家族的ETV1、ETV4与ETV5，c-Jun）相关性。

1.8 统计学分析

表2示，正常食管黏膜组织有6例细胞膜表达，2例细胞质表达，8例混合表达，其余为无表达，而食管腺癌组织样本中CEACAM1细胞膜表达33例(27.3%)，细胞质表达58例(46.8%)，其余31例为混合表达。两组比较差异有统计学意义，χ2=7.567，P=0.022。

采用SPSS16.0 软件进行统计学分析，所得的实验数据均用均数±标准差表示，采用单因素方差分析检验，以<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RFWD2在小鼠全脑表达谱

小鼠全脑冠状面冷冻切片三色免疫荧光检测表明，RFWD2 在大脑皮层与海马区均高表达（图1A，白箭头），而且与突触囊泡蛋白（SYN）具有明显的共定位。在大脑皮层新皮质神经细胞第5 层（节细胞层），RFWD2高表达于大中型锥体细胞，树突顶端伸到第一层（分子层）（图1B，白箭头）。利用Western blot检测小鼠大脑皮层不同发育时期RFWD2与SYN蛋白的表达水平及其相关性，结果显示RFWD2在小鼠大脑皮层中具有两个亚型（isoform），出生后随着个体发育高相对分子质量亚型表达量显著降低，而低相对分子质量亚型自个体出生后开始表达，随着个体的发育14 d后，表达量不断增加，而且与突触形成发育具有明显的正相关性（图1C）。

2.2 RFWD2在小鼠大脑皮层神经元中的表达与定位

取E16胎鼠体外培养大脑皮层神经元（图2A），细胞生长状态良好。体外培养至21 d（Div21），经三色免疫荧光检测表明，RFWD2 免疫荧光在神经元胞体和树突（图2B、C）中均呈点状分布。绿色荧光RFWD2斑点可与突触后膜标记PSD95红色斑点共定位，形成黄色斑点（图2B，紫色箭头），但亦有一些RFWD2 斑点与PSD95斑点紧靠在一起（图2B，白色箭头）。而且，绿色荧光RFWD2斑点与突触前膜标记SYN红色斑点共定位，形成黄色斑点（图2C，紫色箭头），亦有一些RFWD2斑点与SYN 斑点紧靠在一起（图2B，白色箭头）。RFWD2与SYN、PSD95突触蛋白细胞内共定位表明，RFWD2在小鼠大脑皮层神经元的突触前膜及突触后膜均有表达。

取孕16 d小鼠胚胎大脑皮层神经元，以0.12×10/孔接种至Poly-D-lysine 包被的Coverslips 上。使用Neurobasal培养基（添加1% B27+A，0.25% Lglutamine，1%双抗），体外培养至14～21 d，4%多聚甲醛固定后，用2%BSA、10%驴或羊血清和0.2%Triton X-100 封闭1 h 后，使用鸡抗Map2、鼠抗RFWD2、兔PSD95或兔SYN进行突触标记的免疫荧光染色，分析确定RFWD2 在体外培养小鼠大脑皮层神经元的共定位。

2.3 RFWD2过表达对大脑皮层神经元突触蛋白表达的影响

用pCMV-RFWD2-Myc 过表达载体和FUGWGFP（4∶1比例）的混合物进行电转染小鼠大脑皮层神经元，确保超过90%表达GFP的神经元含有RFWD2-Myc。RFWD2过表达可显著降低神经元突触蛋白的形成与数量（图3A、B），SYN斑点数量由17.2±2.4/10 μm降低至4.5±1.2/10 μm（<0.01）；而PSD95斑点数量由8.5±1.3/10 μm降低至2.1±0.3/10 μm（<0.01，图4C）。

2.4 RFWD2抑制表达在大脑皮层神经元突触蛋白表达的影响

使用4%多聚甲醛灌注取成年小鼠全脑，25%蔗糖脱水处理后，采用冷冻切片机（CM1950，Leica，德国）将灌注的大脑切成12µm厚的冠状面切片，并收集在涂有明胶的载玻片上。经2%BSA、10%驴或羊血清和0.2%Triton X-100封闭1 h后，使用鼠抗RFWD2和兔抗SYN双重染色，在避光、室温条件下与二抗Alexa Fluor 488（1∶500）或Cy3（1∶800）孵育1 h后，共聚焦显微镜扫描，CaseViewer 软件分析RFWD2 在小鼠全脑的表达谱。

2020-057）。

60年前的兰州市西固区，是一片荒凉之地，“地上不长草，风吹石头跑”。老一辈“两兰人”硬是依靠人拉肩扛在滩涂地上建起了炼化生产企业，生产出了新中国第一批汽煤柴油和丁苯橡胶。新一代兰州石化人牢记使命，砥砺前进，续写了新的辉煌，实现了炼油化工从无到有、从小到大、由弱到强的巨变。

2.5 RFWD2在小鼠树突棘形成中的功能效应

对照组树突棘头靠近树突干，多为短粗型或蘑菇型，具有成熟树突棘的典型特征。RFWD2-shRNA 组树突棘密度显著降低，而RFWD2过表达组树突棘密度显著增加，尤其丝状伪足样细长树突棘显著增加；与对照组相比，RFWD2抑制表达降低了树突棘的数量，树突棘密度由6.2±0.5/10 μm 降低至4.3±0.2/10 μm（<0.05）；和RFWD2过表达相比，RFWD2抑制表达降低了树突棘的数量，树突棘密度由6.9±1.1/10 μm降低至4.3±0.2/10 μm（<0.01，图5A）。而且，RFWD2过表达可显著增加神经树突棘的数量，而RFWD2-shRNA降低内源性RFWD2 表达，明显降低神经树突棘的数量（图5A）。对培养14～21 d的大脑皮层神经元用Image J进行Sholl分析发现，RFWD2过表达可显著增加神经树突的长度、分支数量及复杂性，而RFWD2抑制表达可显著降低神经细胞树突长度、分支数量及复杂性（图5B）。

2.6 RFWD2影响大脑皮层神经元功能的分子机制

Western blot检测RFWD2与下游各种底物之间的相关性，RFWD2过表达可显著降低Pea3家族的ETV1、ETV4、ETV5与c-Jun的表达，并降低神经元突触蛋白SYN 与PSD95的表达，而RFWD2抑制表达可显著提升Pea3家族的ETV1、ETV4、ETV5与c-Jun的表达，并提升神经元突触蛋白SYN与PSD95的表达（图6A、B）。

3 讨论

树突棘是树突分支上的棘状突起，是神经元间形成突触的主要部位，位于突触后区域，其数量及形态结构的变化会导致突触可塑性的改变，与神经系统发育及学习记忆功能密切相关。树突棘数量减少及形态结构畸变是许多神经退行性疾病发病的基础。蛋白质降解在神经系统发育和神经变性中具有许多关键功能，尤其在发育期间突触连接的细化和突触可塑性的记忆方面。E3泛素连接酶RFWD2作为脑神经元突触蛋白内稳态的一个关键调控因子，可调控神经元树突棘的形成和突触功能。

本研究发现，RFWD2在小鼠大脑皮层与海马区均高表达，尤其高表达于大中型锥体细胞，个体出生14 d后，表达量不断增加，与突触形成具有明显的正相关性。RFWD2 与SYN、PSD95 等突触蛋白细胞内共定位表明，既存在叠加亦有区别，因此RFWD2在小鼠大脑皮层神经元的突触前膜及突触后膜均有表达。RFWD2的高表达可显著降低神经元突触蛋白（SYN、PSD95）的形成与数量，而RFWD2的抑制表达可显著提高神经元突触蛋白的数量，因此，泛素化连接酶RFWD2可能通过泛素化降解，调控神经元突触蛋白表达，从而影响神经元功能。

研究发现RFWD2的失活能够导致小鼠肺分支发育缺陷。RFWD2完全缺失的小鼠在胚胎发生过程中死亡，并伴有严重的心血管缺陷。在神经退行性疾病阿尔兹海默症中，RFWD2缺失会激活小胶质细胞增殖并介导神经炎症，但其分子机制目前尚不清楚。而本研究发现RFWD2过表达可增加神经树突的长度、分支数量及复杂性，而RFWD2抑制表达可明显降低神经树突的长度、分支数量与突触功能，同时大量神经元死亡。另外，对照组树突棘头靠近树突干，多为短粗型或蘑菇型，具有成熟树突棘的典型特征，RFWD2-shRNA组树突棘形态异常，树突棘密度显著减少，而RFWD2过表达组树突棘密度显著增加，但丝状伪足样细长树突棘明显增加。因此，RFWD2差异表达，引起神经元树突棘形态和密度发生显著变化，导致树突棘与突触连接的稳定性发生变化，从而影响大脑皮层和海马等脑区突触可塑性的基础。

RFWD2敲除小鼠能够显著提高ETV1、ETV5与c-Jun 的表达，而过表达的ETV1、ETV5 与c-Jun 又导致RFWD2敲除小鼠死亡。翻译后c-Jun的调节对神经发生至关重要，因为从神经干细胞中c-Jun的提高会降低细胞存活率。在此基础上，本研究表明RFWD2抑制表达可显著提升Pea3家族的ETV1、ETV4、ETV5与c-Jun的表达，并提升神经元突触蛋白SYN的表达，但会导致神经元树突长度、分支数量与复杂性降低，树突棘密度降低，阻断神经元许多功能通路之间的连接，导致突触功能障碍，从而导致神经元死亡。

因此，本研究表明RFWD2能够通过调节Pea3家族的ETV1、ETV4、ETV5与c-Jun的泛素化修饰，调控小鼠大脑皮层神经元树突发育、树突棘形成与突触功能效应，为深入研究神经精神疾病的发生、发展机理及治疗提供一个高效的作用靶点。