肝细胞癌中促癌miRNA 调控网络分析与验证

肝细胞癌（LIHC）是最常见的癌症之一，每年新增确诊病例约60万人。尽管过去几十年治疗手段一直在发展，肝癌病人整体的预后情况仍然较差，5年期存活率仍不足20%。miRNAs是一类小的非编码RNA分子，是近年来众多研究领域中的研究热点，在许多生物学进程中扮演重要角色，包括调控细胞分化、增殖和细胞死亡等。已有大量的研究显示miRNAs及其靶标基因的表达失调，在许多癌症的发生和发展进程中发挥重要的功能。近年来，随着肿瘤相关的二级数据库的出现和日益完善，使得研究者能够对特定癌种中的表达失调的miRNA 及其调控靶标进行系统的挖掘研究。然而，围绕肝细胞癌中生存相关的促癌miRNA的系统性研究还未见报道。本项研究旨在鉴定肝细胞癌中表达失调并且与生存相关的促癌miRNA，鉴定和分析它们的靶标基因并构建相应的miRNA-mRNA调控网络，并对关键miRNA-靶基因进行验证，以期可以为促癌miRNA在肝癌的发生和进展中的功能和机制提供新的线索或提示。

1 材料和方法

1.1 促癌miRNA的鉴定

从OncoLnc 数据库中下载肝细胞癌（Liver hepatocellular carcinoma，LIHC）中的miRNA的数据信息（http：//www.oncolnc.org/download/），提取其中生存相关的miRNA（Raw-value<0.05）形成数集A；在OncomiR 数据库中选择 Liver hepatocellular carcinoma，设置<0.05，提取生存相关的miRNA形成数集B（http：//www.oncomir.org/oncomir/search_cancer_surv_miR.html）；数集A和数集B取交集，形成数集C作进一步分析；数集C中的每个miRNA依次在OncoLnc 中检测生存曲线（http：//www.oncolnc.org/），在OncomiR 中作表达分析（http：//www.oncomir.org/oncomir/search_miR_tumor.html），最后我们将在肝细胞癌中表达量较癌旁组织升高的，并且高表达提示预后更差的miRNA鉴定为LIHC中的促癌miRNA。

1.2 生存相关靶基因的分析与鉴定

在miRnet 中设置好选项：Organism，（human）；ID type，miRBase ID；Tissue，Not specified；Targets，genes（miRTarbase v8.0+TarBase v8.0+miRecords）。将促癌miRNA的list直接粘贴到miRnet数据库（https：//www.mirnet.ca/miRNet/upload/MirUploadView.xhtml）中，点击“Submit”，然后“Proceed”，得到所有预测的miRNA-靶基因对信息。

将靶基因按200个一组粘贴到GEPIA2中Survival Map工具中的Gene or Transcript框中；Active Datasets选择LIHC，点击“Plot”键进行批量的生存相关性分析，结果中蓝色框表示该基因与生存期相关，并且高表达提示更好的预后（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#survival）；经GEPIA2 生存分析筛选得到的靶基因进一步利用Ualcan中的“Scan my genes”工具进行批量的表达分析（http：//ualcan.path.uab.edu/analysis.html）；经GEPIA2和Ualcan 双重分析后筛选到的靶基因与其对应的miRNA在Starbase数据库中作miRNA-mRNA的共表达系数分析（http：//starbase.sysu.edu.cn/panMirCoExp.php），<0.05 被设定为具有统计学上的意义，对应的mRNA才被认定为对应肝细胞癌中促癌miRNA的生存相关靶基因。

1.3 miRNA-mRNA调控网络的构建

将鉴定出的促癌miRNA 的生存相关靶基因和miRNA 一一对应形成一个矩阵文件，将其导入Cytoscape软件形成可视化相互关联网络图，再作进一步的调整和处理形成清晰的miRNA-mRNA 调控网络图。

1.4 靶基因富集分析

为了分析生存相关的靶基因所参与的细胞内信号通路，我们进行了富集分析，结果显示富集程度最高的为脂肪酸代谢信号通路（图3A），富集在该通路的基因包括EHHADH，GCDH，ACAT1，ADH1C 和CYP4A11（图3B）。

1.5 蛋白互作网络分析及关键基因鉴定

将鉴定出的生存相关靶基因列表拷贝到STRING数据库的粘贴框（https：//www.string-db.org/cgi/input？sessionId=bMa3IQdZVRH6&input_page_active_form=multiple_identifiers），点击“search”，“continue”得到蛋白互作网络图；下载对应的TSV格式文件，将矩阵数据信息导入Cytoscape软件，利用cytohubba插件进行关键基因的分析和鉴定。

1.6 关键基因的表达和生存分析

单个基因的生存分析在GEPIA2 中完成，在“survival analysis”界面输入基因名，选择癌种，点击“Plot”键即可生成生存曲线图；单基因的表达分析在Ualcan 中完成，在“Enter gene symbol”框中输入基因名，选择癌种（TCGA dataset），点击“Explore”键后在生成的界面点击“Expression”即可生成表达的箱线图。

（2）范围加载。根据点位风险评价结果，加载点位风险评价结果，初步划定风险评价单元。按照主导性原则，若每项污染物80%以上的土壤点位分类结果一致时，则采用该结果判定该项污染物所代表的评价单元类别。

1.7 关键基因与miRNA调控关系及细胞功能验证

称取一定量的纯化后的玫瑰茄花色苷冻干粉，配制成1 g/L的花色苷溶液，用0.2 mol/L Na2HPO4和0.1 mol/L柠檬酸缓冲液配制成pH=2.2的花色苷溶液，分装5个带帽试管中，每个试管中的花色苷溶液体积均为20 mL，其中海藻酸钠、CMC和β-环糊精均按浓度比取 1.0%，分别放置在 80 ℃、90 ℃恒温水浴锅和100 ℃的恒温油浴锅中，避光加热150 min，每隔30 min测定5组花色苷含量的变化。为避免溶液在加热过程中水分蒸发而引起浓度变化，每次取样后，标记好水位线，下次取样测量前用相同温度的蒸馏水将花色苷溶液补充至前一次取样后的水位线。

人肝癌细胞株HepG2 用RPMI 1640 培养基（含10%胎牛血清）于恒温培养箱（5%CO、37 ℃）中培养。hsa-miR-1226-3p，hsa-miR-221-5p 的mimic 和inhibitor，对照的NC，以及荧光素酶报告质粒（p-GCDH-WT和p-GCDH-MUT），过表达质粒pEGFP N1-GCDH均由公司合成而得。Q-PCR、Western blot及Transwell实验均按常规标准操作步骤进行。荧光素酶活性检测按试剂盒说明书操作。EHHADH上游引物：TGAGGAAA TGAGCCTGAAGA，下游引物：ATAACAGTGGCAA TGGTAGTG；GCDH 上游引物：GGGTGGACAGTGG CTACAGG，下游引物：TAGGGTGCATGACGAGGG AG；内参基因ACTB上游引物：ACTCTTCCAGCCTT CCTTCC，下游引物：TGTTGGCGTACAGGTCTTTG。GCDH抗体（Proteintech，1∶1000），β-Actin抗体（CST，1∶5000）。

2 结果

2.1 肝细胞癌中促癌miRNA及其生存相关靶基因的鉴定

我们选取了EHHADH，GCDH两个关键基因和其对应的miRNA进行了实验验证。Q-PCR结果显示，向HepG2 细胞中分别转染hsa-miR-1226-3p 和hsa-miR-221-5p的mimics后，EHHADH和GCDH的表达量对应的发生显著下调（图6A）。而向HepG2细胞中分别转染hsa-miR-1226-3p 和hsa-miR-221-5p 的inhibitor 后，EHHADH 和GCDH 的表达量相应的上升（图6B）。CCK8 结果显示，转染hsa-miR-1226-3p 的mimics 和inhibitor后，细胞增殖活力的改变并不明显（图6C）。而转染hsa-miR-221-5p 的mimics 和inhibitor 后，可显著地促进或抑制细胞的增殖活力（图6D）。

促癌miRNA的生存相关靶基因的鉴定流程如图1B所示。miRnet数据库中预测出10 278 个基因为上述促癌miRNA的靶基因；经GEPIA2数据库的表达分析后有129 个符合预期；再经Ualcan生存分析后有44个符合预期；Starbase数据库中作miRNA-mRNA的共表达系数分析后，有27 个mRNA 与其对应的miRNA的共表达关系符合预期的负相关关系，形成45 个miRNA-mRNA对（表2）。这45 个mRNA即为这些促癌miRNA的生存相关靶基因。

唐玄奘，前世为如来二弟子金蝉子，法号“玄奘”，被尊称为“三藏法师”，后世俗称“唐僧”，受大唐皇帝之托组建取经四人组，从东土大唐出发，到西天拜佛求取真经。唐僧作为整个取经团队的领袖，负责整个团队的经营和管理，和车间主任的岗位较为相似。每天要掌控车辆的维修进度，协调车间的日常管理工作，对那些不听话的人员不时还要念念“紧箍咒”。当然除了管理之外还要配合其他部门完成相应工作，关心自己团队人员的工作与生活困难，遇到问题时还要帮忙解决。总的来说唐僧的工作比较繁琐，需要由胆大心细、有责任心的人来做。

2.2 miRNA-mRNA调控网络的构建

目前，高职教师到企业挂职锻炼的时间一般为2-6个月（一个学期），最长也仅为1年（一个学年），挂职的时间相对较短。在短时间内，教师很难做到与企业岗位、企业团队和企业管理等相融合，与企业的融合度不够。因时间相对较短，企业也存在着不愿意将关键核心的岗位安排给挂职教师，通常会安排相对清闲的岗位，仅安排一些协作性、临时性的工作。

基于上述分析鉴定的结果，我们构建了肝细胞癌中促癌miRNA及其生存相关靶基因的调控网络（图2）。该调控网络由25 个促癌miRNA和27 个生存相关靶基因组成，其中hsa-mir-940 靶向最多的基因（6 个），CPEB3可被最多的miRNA靶向（7 个）（图2）。

2.3 靶基因富集分析及关键基因鉴定

将鉴定出的生存相关靶基因列表拷贝到Enrichr数据库中的粘贴框中，点击“submit”进行富集分析（https：//maayanlab.cloud/Enrichr/），在“pathways”菜单栏下可查询KEGG富集的结果信息。

我们选择了hsa-miR-221-5p/GCDH进行了进一步的验证。Western blot 实验结果显示，转染hsa-miR-221-5p 的mimics和inhibitor 后，GCDH 的蛋白水平发生相应的下调或增加（图7A）。序列分析鉴定出了GCDH与hsa-miR-221-5p的结合位点（图7B）；利用结合位点附近的序列我们构建了正常序列的（WT）和突变序列的（MUT）荧光素酶报告质粒（图7B）；将hsa-miR-221-5p或NC的mimics 与两种质粒分别组合，共转染HEG2细胞，检测结果显示hsa-miR-221-5p的mimic可以显著降低正常序列质粒（GCDH-WH）组的荧光素酶活性（图7C）。

利用Ualcan 做表达分析的结果显示，EHHADH，GCDH和ACAT1在肝细胞癌组织中的表达水平较正常组织显著升高（图5A～C）；GEPIA数据库得到的生存分析结果显示，EHHADH，GCDH和ACAT1高表达的患者比低表达的患者总体生存率更高（图5D～F）。

促癌miRNA的鉴定流程如图1A。从OncoLnc数据库中下载到486 条miRNA的数据信息，其中生存相关的miRNA 为146 个（<0.05）；OncomiR 数据库中，提取生存相关的miRNA为223个（<0.05）；两者的交集为131 个；在OncoLnc检测miRNA的预后价值，发现120 个miRNA的高表达提示预后结果更差；进一步在OncomiR中逐个作miRNA的表达分析后发现有48 个miRNA在肝细胞癌组织中的表达量较癌旁组织升高。依据分析结果我们将这48 个miRNA定义为肝细胞癌中的促癌miRNA（表1）。

进一步用STRING数据库的分析得到生存相关靶基因的蛋白互作网络（图4A）；将该网络导入Cytoscape软件，利用Cytohubba插件中的Closness，Degree，DMNC，EPC，MCC及MNC算法得到排名前9的基因（图4B）；在此基础上，再取交集得到排名前三的关键基因为EHHADH，GCDH和ACAT1。

CCK8结果显示，转染pEGFP N1-GCDH可抑制细胞的增殖活力，并且可以拯救由hsa-miR-221-5p 的mimics带来的增殖促进效应（图8A）。Transwell实验结果与CCK8结果保持一致，过表达hsa-miR-221-5p可增加细胞的迁移和侵袭能力，而过表达GCDH可抑制细胞的迁移和侵袭能力；并且GCDH 可恢复由hsamiR-221-5p 过表达形成的迁移和侵袭能力的增强（图8B～E）。

除以上柴油机特征参数外，还可通过柴油机排放气体成分及浓度分析、柴油机振动分析和燃油供给系统的压力监测等，为柴油机故障诊断提供更充分的依据。[9-12]随着科学技术的发展，更多监测技术将在船舶上得到应用，为船舶安全提供更为有利的保障。

3 讨论

肿瘤发病分子机制的研究有助于新的诊断和预后标志物的开发，以及可能的新的治疗靶点的发现。随着生物数据量的急速增加和生物信息学的快速发展，近年来，肿瘤相关的二级数据库逐渐出现并且功能也日益完善。这使得许多研究者能够方便地对特定癌种中的基因表达异常进行系统的研究。然而，围绕肝细胞癌中生存相关的促癌miRNA的系统性研究还未见报道。本项研究中，我们分别从OncomiR和Oncolnc数据库中下载了肝细胞癌中生存相关的miRNA，再取两者的交集，提高了筛选结果的可靠性。通过表达和生存分析明确有48 个miRNA 为促癌miRNA。其中部分miRNA在肝细胞癌中的功能及其作用机制已有较为细致的报道。如hsa-miR-183-5p，hsa-miR-222-3p，hsa-miR-421，hsa-miR-940和hsa-miR-9-5p等。还有部分促癌miRNA在肝细胞癌中的功能还未见文献报道，因此，这些miRNA也值得未来进一步研究。为了探究促癌miRNA促进肝细胞癌发生、发展的分子机制，我们通过miRnet数据库预测了促癌miRNA的靶基因，并通过GEPIA2 的生存分析和Ualcan 的表达分析，以及Starbase中的miRNA-mRNA的共表达分析，最终鉴定出了27个与肝细胞癌病人生存相关的靶基因。通过靶基因和miRNA的对应关系，我们构建了肝细胞癌中促癌miRNA 和生存相关靶基因的调控网络，由25 个miRNA和27个靶基因组成。该网络可能部分揭示了促癌miRNA导致肝细胞癌发生和发展，以及影响病人预后的分子机制。该网络中少数miRNA-mRNA的调控关系已经有了实验性的报道给予了支持。例如，有研究报道hsa-miR-9-5p可靶向ACAT1 mRNA 的3’端非转录区，降低其蛋白表达水平。然而，更多的调控关系则需要以后进一步的研究和验证。

相关研究表明，影响数控机床热变形误差的主要原因是主轴部件热变形误差，由于实验条件有限，并且这篇论文主要是验证LWT-LSSVM建模预测方法的可行性与准确性，所以只对数控机床部分发热部件进行实验分析和研究。

为了研究生存相关的靶基因可能集中作用的信号通路，我们做了富集分析，结果显示有5个生存相关靶基因（EHHADH，GCDH，ACAT1，ADH1C 和CYP4A11）富集在脂肪酸代谢信号通路中。以往的研究报道表明，脂肪酸参与合成细胞质膜及相关信号分子，在肿瘤进展中发挥重要作用。进一步通过蛋白互作网络的构建及关键基因分析，鉴定出EHHADH，GCDH 和ACAT1为这些生存相关靶基因中的关键基因。这三个基因在我们构建的miRNA-mRNA网络中分别与hsa-miR-1226-3p，hsa-miR-221-5p 和hsa-miR-9-5p形成靶向关系。ACAT1在不同肿瘤中的功能已经有报道。hsa-miR-9-5p与ACAT1的靶向关系也有实验数据的支持。但是，hsa-miR-1226-3p/EHHADH和hsa-miR-221-5p/GCDH 的调控关系目前还未见报道。在本研究中，Q-PCR结果支持了它们与靶基因的特异性调控关系。然而CCK8 结果仅支持hsa-miR-221-5p在肝癌细胞中有功能。为此，我们通过Western和荧光酶报告实验进一步证实了hsa-miR-221-5p/GCDH的靶向关系。细胞功能实验证实，hsa-miR-221-5p具有促进细胞增殖和侵袭、迁移的能力，而GCDH则发挥的是抑制的功能；过表达GCDH 可恢复由hsamiR-221-5p表达上调导致的细胞增殖能力及侵袭、迁移能力的增强。这些结果表明hsa-miR-221-5p/GCDH轴在肝细胞癌的中发挥重要的调节功能。同时，验证实验也表明本研究中构建的促癌miRNA和生存相关靶基因的调控网络具有较高的可信度；然而，更多分子的调控关系和功能仍需要以后进一步的研究。

总之，本研究基于数据库对肝细胞癌中生存相关的促癌miRNA进行了系统性的挖掘和研究，并对鉴定到的关键miRNA/靶基因对进行了实验验证，这些结果有望为肝细胞癌的发病机制和治疗提供新的线索。