补肾化痰方治疗多囊卵巢综合征的作用机制：基于网络药理学和分子对接方法

多囊卵巢综合征（PCOS）是女性最常见的妇科内分泌疾病，伴有生殖功能障碍和代谢异常，影响患者一生的健康及生命质量。如今，PCOS已被视为生殖医学领域不可忽视的重大疾病。现代医学主要采用激素替代、促排卵联合辅助生殖技术进行治疗，但存在妊娠率低、副作用大的风险。近年来，中医从宏观辨证入手，采用辨证与辨病相结合的方法进行治疗，取得了一定的疗效，展示了中医药治疗PCOS的优势。

补肾化痰方是江苏省中医院生殖医学科临床常用经验方。前期研究表明，补肾化痰方能够改善胰岛素抵抗，可能与胰岛素信号传导分子蛋白表达的调控有关。而胰岛素抵抗是PCOS 的关键发病机制之一。Zhou等进行了一项用于识别多囊卵巢综合征临床紊乱的非侵入性尿代谢组学研究，表明尿液中小分子代谢物的差异可能反映了多囊卵巢综合征的潜在发病机制，其中PCOS患者的甲基丙二酸水平明显高于健康受试者，维生素B12缺乏引起的甲基丙二酸升高可能与多囊卵巢综合征患者的胰岛素抵抗有关。Zhang等采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）血清代谢组学方法，探讨PCOS患者高雄激素血症和胰岛素抵抗患者的代谢紊乱途径，也发现了差异代谢物能反映PCOS 的潜在机制，并可作为HA与IR互补诊断的生物标志物。这都提高了对多囊卵巢综合征潜在作用机制的认识。但目前为止，对其作用机制难以提供较为科学、全面、有效的阐释。本课题组基于多年的临床及基础研究，利用与中医药学整体观和辨证论治理论体系相契合的网络药理学方法和分子对接技术，结合动物实验，探究并验证补肾化痰方治疗多囊卵巢综合征的潜在活性成分、作用靶点、信号通路等相关机制，以期为进一步的临床运用和实验研究提供客观科学依据。

综上所述，小测验不仅可以作为PBL课堂的一种可以接受的考察形式，而且还可以作为一种提高学生学习动力、学习成绩和提高课堂表现的一种简单方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级雌性C57BL/6J小鼠24只，3周龄，体质量15～20 g。实验动物由南京中医药大学动物中心提供，本实验经南京中医药大学动物护理和使用委员会批准（伦理号：012071002387）。

1.1.2 药物 补肾化痰方颗粒剂（仙灵脾10 g、仙茅10 g、苍术10 g、半夏6 g、陈皮6 g、九节菖蒲10 g、香附10 g、川芎6 g、泽泻10 g、鹿角霜10 g、胆南星6 g、砂仁3 g、炒白术6 g、淮山药6 g）由南京中医药大学附属医院药剂科提供。

研究结果表明，将本实验粗提到的线粒体用缓冲液悬浮，加入到铺设好蔗糖密度梯度的超速水平离心管中，经超速水平离心后出现分层。处理1中分层不明显(图1)，且重复性不高，3管均出现不同情况的分层，线粒体层聚集不明显，无法准确吸取线粒体层。处理2分层效果明显(图2)，且3管分层均相同，可以看到明显的线粒体层，有利于线粒体的收集。实验结果说明处理2中改进的蔗糖密度梯度效果最佳。

根据KEGG通路分析结果，选取前20位，分别建立通路与对应靶点之间的相互作用关系和节点属性与对应靶点之间的相互作用关系，并导入Cytoscape 3.7.2 软件中，对“通路-靶点”关系网络进行可视化分析，构建补肾化痰方治疗多囊卵巢综合征的“通路-靶点”关系网络图（图6）。

酶标仪（Rayto），台式高速冷冻离心机（DRAGONLAB），涡旋混合器、磁力搅拌器（Servicebio），超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物）。

1.2 方法

1.2.1 补肾化痰方活性成分的收集与筛选 利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https：//tcmspe.com/）检索，并查阅已发表的相关文献以补充，收集补肾化痰方（仙灵脾，仙茅，苍术，半夏，陈皮，九节菖蒲，香附，川芎，泽泻，鹿角霜，胆南星，砂仁，炒白术，淮山药）的主要活性成分，以药物成分口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为条件作进一步筛选。将最终得到的活性成分导入化学信息数据库Pubchem，检索各个活性成分的规范SMILES 结构和化学结构式。

1.2.6 KEGG“通路-靶点”关系网络的构建 根据KEGG通路分析结果，选取前20位，分别建立通路与对应靶点之间的相互作用关系和节点属性与对应靶点之间的相互作用关系，并导入Cytoscape 3.7.2软件中，构建补肾化痰方治疗多囊卵巢综合征的“通路-靶点”关系网络图。

1.2.3 PCOS 靶点的预测 以GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org/），OMIM 数据库（https：//omim.org/）为平台，“Polycystic Ovary Syndrome”为关键词进行搜索，取交集并删除重复靶点，获取PCOS靶标，运用Uniprot（https：//www.uniprot.org/）数据库对疾病靶点和药物靶点进行官方校正。通过Draw Venn Diagram网站在线分析，绘制药物-疾病靶点的韦恩图（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），获得其交集靶点。

本校为化工原理认识实习提供了充足的资金支持，由化工原理教研室联系实习场所，近几年来，先后联系了青岛市内的化工厂(现已迁至董家口)、青岛双桃精细化工(集团)有限公司(现已迁至平度市)、青岛石油化工厂、青岛污水处理厂(胜利桥)、青岛市中等职业技术学校和校内仿真实习机房等场所.认识实习的学时非常短，只有一周时间，如何在短暂的时间内完成所有的实习任务，并确保认识实习的质量，这是认识实习面临的主要问题；同时，在工厂实习首先必须满足企业安全生产的要求，并且保证学生的安全.

1.2.4 补肾化痰方治疗PCOS的PPI网络分析及核心靶点筛选 利用STRING（http：//www.string-db.org/）数据库，以“Multiple proteins”为数据分析模式、“Homo Sapiens”为物种限定、Required Confidence（combined score）>0.9为阈值，对交集靶点进行相互作用关系分析。后导入Cytoscape3.7.2 并利用CytoNCA插件，以Degree值大小对各靶点进行排序，取排名前十的靶点为核心靶点。

1.2.5 GO 富集与KEGG 通路分析 通过DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）网站，借助“Functional Annotation Tool”对交集靶点进行GO富集分析，包括生物过程、细胞成分和分子功能3 个模块的分析，以<0.05和FDR<0.05为标准筛选，根据涉及靶点数目排序，选取前30位；同时对交集靶点进行KEGG通路分析，以<0.01为筛选标准，根据值大小排序，选取前20位。

为了量化喷施过程中的雾滴飘移情况，将辅助气流出口下风向5m处的位置定义为飘失边界，雾滴运动至到喷头下方0.5m以下认为其沉积到标靶或地面上(如图1所示)；把通过该边界的雾滴质量设定为飘移量，飘移量与喷施的药液量的比值定义为飘移率。最终，把雾滴飘移率作为雾滴飘移的评价指标，具体公式为

因此，败血型大肠杆菌病的出现，主要是对羊的血液与组织系统造成破坏，要抓紧时间进行治疗，并通过注射药物提高药物的扩散速度，如此治疗该病的见效速度才能加快。保障羔羊的健康成长。

1.2.2 补肾化痰方潜在靶点的预测 将获得的各个活性成分结构式导入到Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）数据库，限定物种为人，预测其相关作用靶点，再根据相关性的高低选取潜在作用靶点。

1.2.7 分子对接验证 选取成分-靶点网络中核心活性成分Degree值排名前3的β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素与CytoNCA 筛选出来的核心靶点PIK3CA、PIK3R1、APP、AKT1、MAPK1进行分子对接。在PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载核心活性成分的三维结构，结合PDB数据库（https：//www.rcsb.org/）中核心靶点的蛋白结构，运用AutoDock Vina对核心活性成分与核心靶点进行分子对接验证，并利用Pymol对部分结果进行可视化。

1.2.8 动物实验验证 24只SPF级雌性C57BL/6J小鼠按随机数字表法分为3组：对照组、模型组、治疗组，每组8只。适应性喂养1周后，利用来曲唑诱导PCOS小鼠模型。对照组：以1mg/（kg·d）生理盐水灌服35 d；模型组：来曲唑1 mg/（kg·d）溶于1%羧甲基纤维素（CMC）中，连续灌服35 d，并予高脂饲料喂养；治疗组：造模结束后，补肾化痰方颗粒剂以1 mg/（kg·d）溶于5%生理盐水中，连续灌服35 d。小鼠末次给药后，取卵巢组织于-80 ℃保存，以便后续实验进行。

1.2.9 Western blot 检测PI3K、AKT、MAPK1 蛋白表达 取各组小鼠卵巢组织，使用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，经凝胶电泳、转模、封闭后，加入一抗4 ℃孵育摇床过夜，TBST洗涤3次，室温孵育二抗30 min，TBST洗涤3次，曝光，显色。

1.2.10 统计学方法 采用SPSS 24.0统计软件处理，计量资料用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用检验。<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 补肾化痰方活性成分

通过DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）网站，借助“Functional Annotation Tool”对434个共同靶基因进行KEGG富集分析，得141条信号通路，设置<0.01为筛选标准，根据值大小进行排序，选取前20位为主要信号通路如癌症通路、HIF-1信号通路、Rap1信号通路、PI3K-Akt信号通路、雌激素信号通路等（表4）。借助微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）在线网站作KEGG通路富集气泡图（图5）。

利用Genecards 数据库和OMIM 数据库，以“Polycystic Ovary Syndrome”为关键词进行搜索，合并所得疾病靶点，去重，最终得到4759个疾病靶点。将990 个药物靶点和4759 个疾病靶点通过Draw Venn Diagram网站在线分析，获得434个交集靶点，绘制韦恩图（图1）。

2.2 补肾化痰方成分靶点预测结果

将上述所得125个有效活性成分，依次输入Swiss Target Prediction 网站，得到每个成分相对应的药物靶点，以Probability>0为条件进行筛选，导出数据并去重，最终得到990个补肾化痰方成分靶点。

2.3 多囊卵巢综合征靶点预测结果

根据德国联邦统计局的数据，2000—2014年，德国生活垃圾年产生量为5.0×107t左右，整体变化不大，2002年达到高峰值5.277 2×107t。2014年德国生活垃圾产生总量为5.110 2×107t，人均生活垃圾产生量约633 kg/（a·人），即1.73 kg/（d·人），其中剩余垃圾量为0.48 kg/（d·人）。

2.4 补肾化痰方治疗PCOS的核心靶点筛选

利用STRING（http：//www.string-db.org/）数据库，以“Multiple proteins”为数据分析模式、“Homo Sapiens”为物种限定、Required Confidence（combined score）>0.9为阈值，对交集靶蛋白进行相互作用关系分析，后导入Cytoscape3.7.2并利用其中CytoNCA插件分析交集网络中各个节点的属性值，计算Degree值的二倍中位数，筛选出大于其值的靶点，构建核心靶点的筛选策略图（图2）。筛选结果从大到小依次排序，取排名前10的靶点为核心靶点，分别为PIK3CA、PIK3R1、APP、KNG1、SRC、AKT1、TP53、MAPK1、MAPK3、BDKRB2（图3、表2）。节点分别代表潜在作用靶点，节点大小与颜色代表靶点的度值，节点越大、颜色越深，表明靶点在网络体系中的度值越大；节点间连线表示靶点间存在潜在的相互作用关系。

2.5 GO功能富集分析

通过DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）网站，借助“Functional Annotation Tool”对434 个交集靶点进行GO富集分析，包括生物过程、细胞成分和分子功能等3个模块的分析，以<0.05和FDR<0.05为标准筛选，根据涉及靶点数目排序，选取前30个GO条目：其中BP相关条目8个，CC相关条目14个，MF相关条目8个，结果显示补肾化痰方治疗多囊卵巢综合征主要靶点的生物过程主要富集在药物反应、凋亡过程的负调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、蛋白质磷酸化、细胞增殖的正调控、氧化还原过程等；细胞组成主要富集在细胞质、细胞膜、胞质溶胶、线粒体、内质网膜等；分子功能主要富集在蛋白质结合、ATP结合、酶结合、锌离子结合等（表3），并借助微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）在线网站作GO富集BP CC MF三合一图（图4）。

2.6 KEGG通路富集分析

通过TCMSP数据库检索，并查阅已发表的相关文献进行补充，以药物成分口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为条件进一步筛选得到补肾化痰方中14味中药包含125个有效活性成分，其中通过查阅文献所得的九节菖蒲主要活性成分为Palmitic acid、Ferulic acid、Adenosine 等；鹿角霜主要活性成分为gamma-Aminobutyric acid、Glutamic acid等；胆南星主要活性成分为Apigenin、Schaftoside、Cholesterol等，其余部分筛选结果如下（表1）。

2.7 KEGG“通路-靶点”关系网络的构建

1.1.3 试剂与仪器 来曲唑（江苏恒瑞医药股份有限公司），BCA 蛋白定量检测试剂盒、RIPA 裂解液、5×蛋白还原型上样缓冲液、磷酸化蛋白酶抑制剂、β-actin、GAPDH、Histone H3、HRP标记山羊抗兔、HRP标记驴抗山羊、HRP 标记山羊抗小鼠、HRP 标记山羊抗大鼠（Servicebio），高脂饲料（金益柏生物科技有限公司）。

2.8 分子对接验证

根据网络拓扑结构分析结果选取核心活性成分Degree 值排名前3 的β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素与CytoNCA 筛选出来的核心靶点PIK3CA、PIK3R1、APP、AKT1、MAPK1分别进行分子对接。一般认为结合能<-4.25 kcal/mol表示配体小分子与受体蛋白之间有一定的结合活性；结合能<-5.0 kcal/mol表明二者之间有较好的结合活性；结合能<-7.0 kcal/mol表明配体与受体具有强烈的结合活性。分子对接结果（表5）可见核心活性成分β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素与核心靶点PIK3CA、PIK3R1、APP、AKT1、MAPK1之间的结合能均小于-5.0 kcal/mol，说明两者之间有较好的结合活性；并且β-谷甾醇与PIK3CA、PIK3R1、APP、AKT1、MAPK1，山奈酚与PIK3CA、APP、MAPK1，槲皮素与PIK3CA、PIK3R1、APP、MAPK1 之间的结合能均小于-7.0 kcal/mol，说明两者具有强烈的结合活性。依据自由结合能的大小，选取部分对接结果进行可视化，利用PyMOL软件绘图（图7）。由图可见，β-谷甾醇能稳定地对接到PIK3CA蛋白结构6GVF的活性口袋中，二者通过氨基酸残基LYS-271发生氢键作用；山奈酚能稳定地对接到AKT1蛋白结构1UNQ的活性口袋中，二者通过氨基酸残基AGR-48和ASN-54发生氢键作用；槲皮素能稳定地对接到MAPK1蛋白结构2Y9Q的活性口袋中，二者通过氨基酸残基GLU-33和LYS-114发生氢键作用。

2.9 补肾化痰方对PI3K、AKT、MAPK1 蛋白表达的影响

Western blot 检测PI3K、AKT、MAPK1 蛋白表达，其中，MAPK1编码ERK1/2。结果表明，与对照组比较，模型组PI3K 蛋白、AKT蛋白表达升高，ERK1/2蛋白（<0.01）表达降低；与模型组比较，治疗组PI3K蛋白（<0.01）、AKT 蛋白（<0.05）表达降低，ERK1/2 蛋白表达升高（图8）。

3 讨论

多囊卵巢综合征是临床上常见的妇科内分泌疾病，好发于育龄期女性，以持续无排卵、卵巢多囊样变、高雄激素血症为特征，临床常表现为月经紊乱、不孕、肥胖、多毛、黑棘皮症等。痰湿证、血瘀证、湿热证是PCOS的主要证候，痰、瘀壅滞胞宫表现为闭经、不孕、卵巢呈多囊样改变；化热则表现出痤疮、多毛等现象。以此长期不断积累，则成为多囊卵巢综合征的发病重要因素。本课题组基于多年的临床及基础研究，采用补肾化痰方以治疗多囊卵巢综合征。补肾化痰方是临床经验方，由苍附导痰汤化载而来。方中仙灵脾、仙茅、鹿角霜补肾益气；苍术、炒白术、半夏、陈皮、九节菖蒲、泽泻、胆南星、砂仁健脾化痰，利水渗湿；淮山药补脾益肾；香附、川芎活血化瘀，调经助孕。全方补肾健脾，化痰逐瘀通经，是临床治疗多囊卵巢综合征的有效方剂。

这些因素在“一脚刹车”时，由于制动协调时间短，气压或液压峰值很快作用在制动器上，因而对于左右轮制动力差影响不明显，而在缓慢制动时，因制动协调时间长而对左右制动力差影响较大，所以往往超过规定数值。

由图2可得，S点为原点，坐标为(0,0,0)，假设由S点出发到F点经过L1,L2,,Ln,Li(xi,yi,zi)表示UAV飞行过程中的第i个节点，因此UAV飞行全过程的路径可表示为

本研究通过TCMSP数据库筛选得到补肾化痰方中共包含125个有效活性成分，对应990个药物靶点，多囊卵巢综合征的相关作用靶点4759个，将药物靶点和疾病靶点通过Draw Venn Diagram网站在线分析，获得434个交集靶点。根据上述所筛选出的结果，可知β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素可能是补肾化痰方治疗多囊卵巢综合征的核心活性成分。β-谷甾醇是四环三萜类化合物，有抗炎、抗氧化、免疫调节、降糖、降脂、降低雄激素等作用。赵帅等发现β-谷甾醇可促进颗粒细胞增殖，抑制凋亡，其机制与PI3K/AKT 信号通路有关。山柰酚是黄酮类化合物，有抗炎、抗氧化、降低血脂、扩张血管、抗肿瘤等作用。有研究发现卵泡生长发育异常可能是引起多囊卵巢综合征无排卵及临床内分泌改变的病理基础。而山奈酚可以在绵羊次级卵泡的体外培养过程中保持卵泡存活率，增加活性线粒体水平并通过介导PI3K 信号通路促进卵母细胞减数分裂。槲皮素是黄酮类化合物，有抗炎、抗氧化、控制葡萄糖稳态、抑制胰岛素分泌等作用。研究证实槲皮素具有降低卵巢直径和体质量，促进卵泡腺外层和黄体功能恢复的作用，还可减轻PCOS患者性激素和代谢紊乱的作用。经网络拓扑属性分析筛选出MAPK1、AKT1、PIK3CA等核心靶点，推测可能是补肾化痰方治疗多囊卵巢综合征的主要作用靶点。PIK3CA是PI3K家族中唯一存在肿瘤特异性突变的基因。在人体各个组织中均有表达的PIK3CA对PI3K/AKT信号通路有激活作用。MAPK1，MAPK3等属于MAPK家族，MAPK通路能负反馈调节PI3K通路，导致PCOS胰岛素抵抗的形成，而胰岛素抵抗是PCOS重要发病机制。GO富集分析显示补肾化痰方治疗多囊卵巢综合征主要靶点的生物过程主要富集在药物反应、凋亡过程的负调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、蛋白质磷酸化、细胞增殖的正调控、氧化还原过程等；细胞组成主要富集在细胞质、细胞膜、胞质溶胶、线粒体、内质网膜等；分子功能主要富集在蛋白质结合、ATP结合、酶结合、锌离子结合等。KEGG富集分析得141条信号通路，根据P值大小进行排序，选取前二十位为主要信号通路如癌症通路、HIF-1信号通路、Rap1信号通路、PI3K-Akt信号通路、雌激素信号通路等。其中，PI3K-Akt信号通路与多囊卵巢综合征密切相关。PI3K-Akt 信号通路与胰岛素抵抗（IR）、糖尿病和代谢疾病密切相关。PI3K通路障碍是PCOS引起IR的主要因素，PI3K通过变构并激活磷酸酰肌醇的激酶进而激活靶蛋白Akt；活化的胰岛素受体β亚基的酪氨酸激酶通过激活胰岛素受体底物，进一步激活PI3K 通路，激活后的PI3K 使其下游靶蛋白Akt多个残基位点发生磷酸化进而激活Akt，导致卵泡膜细胞增生、卵泡异常发育或无排卵等。Qiu等运用六味地黄丸治疗PCOS，发现PI3K-Akt信号通路可通过上调CYP19A1，将雄激素转化为雌激素，减轻IR和卵巢多囊样改变，恢复卵泡的发育，减少闭锁卵泡。可以推测未来将会有更多的PCOS患者受益于PI3K-Akt信号通路的研究。

分子对接结果显示核心活性成分β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素均能与核心靶点PIK3CA、PIK3R1、APP、AKT1、MAPK1稳定结合并形成氢键，初步揭示了补肾化痰方通过多靶点，多通路治疗多囊卵巢综合征的作用特点，可为后期进一步探究其机制提供依据。

为进一步验证补肾化痰方治疗多囊卵巢综合征的作用机制的网络药理学分析结果，结合以上分析最终选取了核心靶点MAPK1和核心通路PI3K-AKT进行动物实验研究。结果表明，补肾化痰方能明显改善多囊卵巢综合征相关症状，并下调PI3K，AKT蛋白表达，上调MAPK1蛋白表达，提示了补肾化痰方可能通过β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素等活性成分作用于MAPK1等关键靶点，并通过介导PI3K-Akt等信号通路发挥抗炎、改善胰岛素抵抗、促进卵泡发育、调节激素水平等药理作用来治疗多囊卵巢综合征。

综上所述，本研究采用网络药理学方法和分子对接技术，结合动物实验初步验证了补肾化痰方治疗多囊卵巢综合征的具体作用靶点和通路，表现了中药、多成分、疾病、多靶点协同作用的药理机制，为进一步探究其作用机制提供了一定的参考依据，为临床上中药治疗多囊卵巢综合征的药效物质基础和作用机制提供了重要理论和实验依据。