偶联CD133核酸适体的载紫杉醇PLGA-PEG 纳米载体靶向清除CD133阳性肺癌干细胞

肺癌是恶性程度极高的肿瘤，也是癌症死亡的主要原因。因此，迫切需要提出一种有效的肺癌治疗方法。然而，肿瘤的复发、多药耐药和转移严重阻碍了肺癌的治疗效果。肿瘤干细胞（CSCs）是指具有干细胞性质的癌细胞，是肺癌的复发和转移的重要原因。CD133抗原是实体瘤（包括肺癌）CSCs的标记物，研究显示，清除CD133肺癌干细胞可以显著提高肺癌治疗效果，miR-122过表达降低了CD133肺癌干细胞的干性（Hedgehog、Notch和Wnt/β-catenin通路），提高了肺癌治疗效果。

高校团委作为高校最大的一个组织，无论在哪一方面的资源获取都具有非常大的优势，在这种情况下，只有高校团委合理的配置各类信息资源，教师专家资源，校外资本引入，才能在一定程度上发挥其在学生创业体系建构上的主导者地位。高校团委在构建创业体系的同时，应该将创业实践活动趋向更加系统化和专门化的发展方向。所谓专门化，便是拥有更加专业的指导队伍，更加专业的学生创业团队，更好的创业实践环境以及学校支撑，将创业理论体系深入课堂、深入实践，使其成为一种专门化的学校教育体系之一；系统性，对创业理论体系、创业实践能力等，要进行系统化的划分，合理的学习、落实和安排，理论与实际相结合，高效的系统学习，拒绝假大空和表面化。

偶联靶向性配体（如核酸适体或抗体）的靶向纳米载体可以提高化疗药物的靶向效果。研究显示，采用生物素-亲和素吸附、共价链接和生物素-亲和素的连接方式，可以将抗体偶联在纳米载体上制备成为靶向纳米载体，该靶向纳米载体能显示出对肿瘤细胞很强的靶向性和内吞活性。尽管抗体广泛应用于靶向纳米载体，但它们面临分子量大、免疫原性强等缺点。核酸适体指的是经体外筛选技术SELEX（指数富集配体系统进化）筛选出的、能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段，具有低免疫原性、低分子量和易于生产等优点。研究证实，核酸适体A15 可以靶向CD133细胞，纳米载体通过A15核酸适体导向性，可以靶向和杀伤CD133细胞。鉴于CD133是肺癌干细胞的标记物，因此，核酸适体A15预期可将药物有效地递送至CD133肺癌干细胞。

纳米载体是一种纳米级别的药物递送载体，能改善药物的溶解度和降低药物毒性。紫杉醇是一种常用的化疗药物，溶解度不好，可以通过纳米载体显著提高紫杉醇的溶解度。聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）是由两种单体—乳酸和羟基乙酸随机聚合而成，是一种可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能，被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域。PLGA纳米载体因其良好的人体安全性而被广泛应用。另外，PLGA纳米载体通过聚乙二醇（PEG）修饰后，其体内循环时间延长，对肿瘤的被动靶向性显著提高。目前尚无研究构建CD133 靶向性的紫杉醇纳米载体实现对CSCs 的靶向性清除。本研究拟构建载紫杉醇的PLGA-PEG纳米载体，该纳米载体与CD133核酸适体偶联后制备成为靶向纳米载体（N-Pac-CD133），预期可以高效靶向清除CD133肺癌干细胞。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 聚（丙交酯-共乙交酯）-b-聚（乙二醇）-COOH端（～17000，3400）（PLGA-PEG-COOH）（Polyscience）。藻红蛋白标记的CD133 抗体和CD133 微珠试剂盒（Miltenyi Biotec）。紫杉醇（大连美仑生物科技有限公司）。A15 核酸适体（序列为5'-SH-CCCUCCUAAGG G-3'）（广州瑞博股份有限公司）。N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、1-乙基-3-3-二甲氨基丙基碳二亚胺（EDC）、表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、1-乙基-3-3-二甲氨基丙基碳二亚胺（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、紫杉醇和香豆素6（Sigma-Aldrich）。StemPro®Accutase®细胞分离试剂、逆转录系统试剂盒、TRIzol®试剂、B27和胰岛素转铁蛋白硒（ITS）（赛默飞世尔科技有限公司）。所有有机试剂（分析级）均由国药集团（中国上海）提供。

1.2 方法

1.2.9 流式细胞术评价纳米载体的体外细胞摄取 将肺癌细胞（5×10/孔）接种于12孔板中过夜。然后将细胞与6-香豆素，C6-N-Pac或C6-N-CD133（香豆素-6浓度：0.5 μg/mL）孵育4 h。最后，用流式细胞仪对细胞进行分析。

唯识学既是世间现象的深刻说明，也是唯识宗道行学的理论支撑,世间现象既然是“唯识无境”，唯识学认为成就佛的智慧根本在于转“识”，转识成智是通达佛智的最根本法门。中国书法是一门高度抽象的艺术，充满深刻的东方哲学思想。无论书法审美鉴赏还是创作，语言难以直接表达书法的玄妙，需要妙悟通达心灵的直觉体验。“转识成智”和书法审美直觉或妙悟二者目标归趣之间存在差异，以唯识观统摄书法、以无漏智的心清净种子借助书法弘扬佛理，二者才有可能存在一定相融和性。

应当看到，高校教材编写对推动科研发展也起着重要的作用，因为它将学科发展的宝贵史料、思想与理论精萃、最新科研成果不断选编、整合为学科的概念与原理的知识体系，还力求反映学科的前沿热点与动态。这将为相关科学研究起着整理资源、提高基础、继往开来的铺垫作用，尤其有助于激发和培养学生的科研兴趣与创新能力，以至直接影响他们参与科学研究。因此，我们要高度评价编好教材的重大意义。在教材编写的过程中，我们也深深感到教材编写是一个在正确思想指导下广泛学习，不断深入研究，反复修改与提高的过程。

1.2.2 实时聚合酶链反应（RT-PCR）采用RT-PCR 检测肺癌细胞中CSCs相关基因的表达。在用TRIzol®试剂提取肿瘤细胞RNA后，用逆转录系统试剂盒反转录第一条链互补DNA，最后用A Roche Light Cycler 进行了RT-PCR，用2的方法检测mRNA表达。

1.2.3 流式细胞术分析CD133表达 收集的细胞与PECD133抗体（1 μg/mL）在4 ℃下孵育30 min，并使用流式细胞术（Becton Dickinson，加利福尼亚州圣何塞）分析细胞的CD133表达。

1.2.4 磁细胞分选 用CD133微珠试剂盒从肺癌细胞中分离出CD133细胞。简要地说，将CD133微球添加到收集的细胞中，将CD133 微球与细胞在4 ℃混合15 min 后丢弃未结合的微球。然后用50 μL PBE（含5 mmol/L EDTA 和0.5%BSA 的PBS）重新悬浮颗粒，并使用磁分离柱分离，洗涤后收集CD133细胞。最后，通过流式细胞术分析细胞的CD133表达。

1.2.7 纳米载体的表征 使用Zetasizer Nano S（英国马尔文仪器公司）分析纳米载体的尺寸、尺寸分布和zeta电位。使用日立H-600透射电子显微镜（TEM，200 kV加速电压）检测纳米载体的形态。纳米载体的紫杉醇包封率和载药量测定如下：将1毫升的纳米载体真空干燥后，然后加入0.2 mL的混合溶液（二甲基亚砜：二甲基亚砜（v/v=3∶1））溶解，超声5 min再加入0.5 mL的甲醇提取紫杉醇，超声5 min，15 000 r/min离心5 min后取上清收集于5 mL 容量瓶，然后再利用高效液相色谱（HPLC）来测定紫杉醇的含量，方法如下：将纳米载体真空干燥后，将1 mL纳米载体溶液完全溶解在1mL甲醇中，用于配备反相C-18 柱（Diamonsil，5 μm，250 mm×4.5 mm）的HPLC（L-2000，日本日立）分析。色谱条件：色谱柱：C18 反相色谱柱（250×4.6 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；流动相：乙腈：水=50∶50（v/v）；流速：1.0 mL/min；检测波长：230 nm；进样量：20 μL。

1.2.6 N-Pac-CD133 的制备和表征 N-Pac-CD133 是通过如下方法制备。首先，利用乳液/溶剂蒸发方法制备N-Pac。将PLGA-PEG-COOH（30 mg）和紫杉醇（5 mg）溶解在二氯甲烷（2 mL）中以形成药物溶液，将其加入胆酸钠水溶液（1%，4 mL）中。使用探针超声仪（45 s，150 W）进行超声处理后，将形成的乳液加入胆酸钠溶液（0.5%，20 mL）中。蒸发后，从乳液中除去二氯甲烷。通过去离子水中超滤除去未包封的紫杉醇。按照上述方法制备空白纳米载体。如上所述添加0.1%（w/w）香豆素-6制备负载香豆素-6的纳米载体。接下来，N-Pac-CD133 通过CD133 核酸适体和N-Pac 化学偶联形成的。首先，用50 mmol/L NHS和100 mmol/L EDC对N-Pac（2.5 mg/mL）进行活化60 min，将洗涤后的N-Pac与CD133适体（1 mL，0.05 mg/mL）孵育6 h以产生N-Pac-CD133，4 ℃储存。

1.2.5 肿瘤球形成率试验 肿瘤球形成率计算方法如前所示。肺癌细胞以3000/孔的密度在超低粘附性6孔培养皿中培养，将细胞悬浮在由DMEM/F12，1×B27，1×ITS，20 ng/mL EGF和20 ng/mL bFGF组成的干细胞培养基中，7 d后计数对形成肿瘤球数进行计数。肿瘤球形成率=实验组肿瘤球形成个数/对照组肿瘤球形成个数。

1.2.8 纳米载体的紫杉醇体外释放 在磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）或含有10%人血浆的PBS中检测纳米载体的紫杉醇体外释放。简要地说，向Spectrum/Por®透析膜（MWCO 1000）中添加5 mL纳米载体溶液，将透析膜加入到含有100 mL的PBS（添加0.1%Tween-20）的烧杯中，在37 ℃（100 r/min）的温和搅拌下在水浴中培养。在不同的时间点吸取1 mL的透析液通过HPLC测量紫杉醇含量。

1.2.1 细胞培养 人肺癌细胞系A549和HCC827由中科院上海细胞所提供。细胞在RPMI 1640培养基（添加10%胎牛血清，0.1 mmol/L MEM非必需氨基酸的L-谷氨酰胺）中培养，细胞在含95%空气/5%CO的37 ℃的细胞培养箱中培养。

体内抗肿瘤实验按照如下步骤进行。在第0天时，在BALB/c裸鼠（雄性，4～6周，～20 g）皮下注射5×10A549细胞，接种后第10天肿瘤体积达到50 mm。小鼠尾静脉注射各种纳米载体和游离紫杉醇（按照5 mg/kg紫杉醇的浓度），分别于第10、15和20天进行注射。肿瘤体积按公式：肿瘤体积=（宽×长）/2进行监测，在第40天时，处死小鼠后，对肿瘤进行摘除并称重。同时测量小鼠的体质量。

1.2.11 用CCK-8法测定细胞增殖试验 用CCK8法检测纳米载体的细胞毒性作用。细胞（1×10/孔）在96孔板中接种过夜。然后用不同浓度的药物（0.15～3000 μg/mL）处理细胞48 h，最后根据试剂盒的方案检测细胞增殖。

在A549 CD133细胞中，C6-N-CD133 处理组的平均荧光强度显著高于C6-N（=0.02）和C6处理组（<0.001，图3A～C）。在A549 CD133细胞中，C6-N-CD133和C6-N处理组的平均荧光强度差异无统计学意义（>0.05）。对于HCC827细胞，获得了类似的结果（图3B、C）。接下来，我们检测了肺癌细胞内吞紫杉醇的浓度（图3D、E）。在A549 CD133细胞中，N-Pac-CD133治疗组的紫杉醇浓度显著高于N-Pac（=0.01）和紫杉醇治疗组（<0.001），而在A549 CD133细胞中，N-Pac-CD133和N-Pac处理组的紫杉醇浓度差异无统计学意义（>0.05）。在HCC827 细胞的情况下，获得了类似的结果（图3D）。

(2)智慧城市发展水平对智慧城市感知质量的假设(H3)、对智慧城市预期的假设(H4)均得到验证，都呈现正相关且在0.001水平下是显著的。这说明随着城市基础设施建设、技术发展以及人才建设的不断完善，提高了智慧城市的建设发展水平，使安居、教育、交通等多个领域实现了智慧化的迅速发展，增强了市民对智慧城市的感知质量，使市民的满足需要性预期得到相应的满足。

最后，从人才培养目标来看，数学素养目标与学习目的缺乏有机统一。这种认识导致学生只能掌握一定数学知识来解决简单问题，难以对数学有更深体验，也不能把数学学习与个人成长、发展有机联系起来，使得数学失去了文化蕴意，教学内容较为空洞，学生学习时感到枯燥乏味，难以了解数学思想方法和精神。

1.3 体内抗肿瘤实验

1.2.10 HPLC评价紫杉醇的体外细胞摄取 用HPLC测定细胞内紫杉醇的摄取量方法如下。肺癌细胞（5×10/孔）在12孔板中接种过夜。然后用紫杉醇、N-Pac或N-Pac-CD133（20 μg/mL紫杉醇）处理细胞4 h。然后用PBS洗涤细胞3次，并通过添加0.4 mL甲醇收集细胞。细胞超声处理1 min 后，离心细胞裂解液（10 000×，10 min），收集上清液。HPLC测定上清液中紫杉醇的含量。用BCA法测定上清液的蛋白质浓度。细胞内紫杉醇摄取量利用紫杉醇浓度/蛋白质浓度进行计算。

1.4 统计分析

采用GraphPad Prism 9统计软件包对数据进行分析。两组之间的直接比较是Student's非配对检验进行的。用单因素方差分析进行3组以上的比较，之后的两两检验采用Dunnett或Newman-Keuls。<0.05时认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 纳米载体的表征

所有纳米载体都很小（～100 nm），多分散性小（PDI<0.2）。具有高负zeta电位（约-20 mV），预示了其在循环中的高稳定性。纳米载体的包封率为8%～9%，载药效率>80%，这些数据表明纳米载体具有合适的尺寸、zeta电位和载药能力（表1）。

两种纳米载体均呈球形，分散性良好（图1A、B）。紫杉醇从N-Pac和N-Pac-CD133中的体外释放（图1C、D）。与PBS 相比，两种纳米载体在含有10%人血清（10%Plasma）的PBS中的释放速度更快（N-Pac 24 h，=0.02；N-Pac-CD133，24 h，=0.002）。纳米载体在最初12 h中，可以快速释放约～50%的紫杉醇。在接下来的36 h的紫杉醇累积释放量为80%。因此，两种纳米载体在48 h内都显示出持续的药物释放。

2.2 肺癌细胞的CD133+细胞群体表现出肺癌干细胞的特征

CD133细胞形成肺癌的体积显著大于CD133细胞（图2A、B）。A549在第30天以后，CD133细胞的平均肿瘤体积明显大于CD133细胞（0.001，图2A）。在HCC827 细胞中，获得了类似的结果（=0.01，图2B）。CD133A549 细胞比CD133A549 细胞生成更多的第一代（<0.001，图2C、D）和第二代肿瘤球（<0.001，图2C）。HCC827细胞获得了类似的结果（图2D）。接下来，我们检测在A549和HCC827的CSCs基因表达。与A549 CD133细胞相比，A549 CD133细胞中OV6（<0.001）、CD133（=0.001）、OCT3/4（=0.002）、EpCAM（=0.04）、NANOG（=0.005）和CD44（=0.02）的mRNA 水平也显著高于A549CD133细胞（图2E）。对于HCC827 细胞，也获得了类似的结果（图2F）。CD133肺癌细胞显示出肺癌干细胞的特征。

因此，建议在模拟英国议会制辩论教学过程中强化中国学生对上述论辩要素敏感性。看到辩题，特别是政策性辩题后，辩手们首先要考虑辩题拟解决的主要问题并迅速确定己方立场。然后针对问题的起因确定解决方案。在考虑解决方案时既要想到其优势，也要考虑其弱势。最后考虑论证己方立场的论点，包括己方动议的合理性、有效性和后果等等。

2.3 体外靶向性实验

1.2.12 纳米载体对肺癌细胞中肺癌干细胞比例的影响 通过肿瘤球形成实验来检测纳米载体对肺癌细胞中肺癌干细胞的影响。简言之，肺癌细胞（5×10/孔）在12 孔板中接种过夜。然后用纳米载体或游离紫杉醇（5 μg/mL紫杉醇）处理细胞。24 h后弃去药物，将细胞与新鲜培养基孵育72 h。然后，将细胞用胰蛋白酶消化后加入到超低吸附板中进行肿瘤球培养。肿瘤球形成率计算公式：实验组肿瘤球形成个数/对照组肿瘤形成个数。

2.4 CCK-8细胞毒性分析

N-CD133（偶联CD133核酸适体的空PLGA-PEG纳米载体）没任何的细胞毒性。相反，紫杉醇、N-Pac和N-Pac-CD133 对CD133和CD133肺癌细胞显示出剂量依赖性细胞毒性。我们使用半数抑制浓度（IC）来定量测量体外细胞毒性（表2）。在A549 CD133细胞中，NPac-CD133 的IC值（7.4 μg/mL）显著低于N-Pac（35.2 μg/mL）（=0.01）和紫杉醇（74.3 μg/mL）（=0.003）。相反，在A549 CD133细胞中，N-Pac-CD133 的IC值（14.3 μg/mL）与N-Pac（21.5 μg/mL）相比无显著差异（>0.05，图4）。因此，在A549 CD133细胞中，N-Pac-CD133的作用是N-Pac的10倍。在HCC827 CD133和CD133细胞中也获得了类似的结果，其中N-Pac-CD133在HCC827 CD133细胞中的效果分别是N-Pac的8倍。

1.2.13 体内实验 由海军军医大学动物中心提供的严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠（20 g，6～8周）在无特定病原体（SPF）条件下繁殖。所有程序均获海军军医大学动物委员会批准，并按照海军军医大学动物伦理委员会的指导方针执行。如下所述，在SCID小鼠中进行体内致瘤性试验，将肺癌细胞（2×10）与BD-Matrigel混合™，并将其植入SCID 小鼠皮下。将CD133和CD133肺癌细胞接种于同一小鼠的两侧。接种后监测肿瘤形成。肿瘤体积=（宽度×长度）/2。

2.5 纳米载体对肺癌细胞中比例的影响

我们利用通过肿瘤球形成实验来验证纳米载体对肺癌干细胞影响（图5）。在A549 细胞中，紫杉醇（=0.01）治疗显著增加了肿瘤球形成率（图5A、C）。值得注意的是，与未经治疗的对照组相比，N-Pac-CD133治疗后，A549肿瘤球数量减少1倍。在A549细胞中，NPac-CD133治疗后肿瘤球的数量小于紫杉醇（<0.001）和N-Pac（<0.001）。类似地，与未经治疗的对照组相比，N-Pac-CD133 诱导HCC827 肿瘤球数量减少1 倍（图5B、C）。N-Pac-CD133治疗后肿瘤球的数量较紫杉醇数量显著减少（<0.001）。

2.6 纳米载体的体内治疗实验

图6显示纳米载体的体内治疗实验。生理盐水和N-CD133无任何抗肿瘤活性，生理盐水和N-CD133治疗组的肿瘤积极进展迅速（图6A）。而紫杉醇、N-Pac和N-Pac-CD133 则表现出不同程度的抗肿瘤活性。NPac-CD133导致肿瘤体积减少92%，达到最佳的治疗效果。N-Pac 和紫杉醇分别达到中等（肿瘤体积减少72%）和轻微（肿瘤体积减少33%）的治疗效果。在治疗终点时，我们取小鼠肿瘤并对肿瘤体质量进行称量，NPac-CD133治疗组和其他治疗组相比，肿瘤体质量显著减小（<0.001，图6B）。我们同时称量了小鼠的体质量，所有处理组小鼠的体质量均逐渐增加，相反，紫杉醇治疗组的体质量逐渐下降（图6C）。

3 讨论

本研究利用CD133 核酸适体和CD133 的相互作用，制备了靶向CD133 的紫杉醇纳米载体N-Pac-CD133，证实N-Pac-CD133具有消除CD133肺癌干细胞的潜力。

紫杉醇是治疗肺癌的有效药物。单纯紫杉醇治疗会增加肺癌干细胞的比例。在本文中，与之前的研究一致，紫杉醇在CD133肺癌干细胞中治疗效果并不好，增加了肿瘤球的形成和CD133肺癌干细胞的比例，表明肺癌干细胞对紫杉醇具有耐药性。我们的研究证实：N-Pac-CD133 对CD133肺癌细胞的毒性比对CD133肺癌细胞的毒性大得多，表明N-Pac-CD133实现了对肺癌干细胞的靶向性递药，同时实现了紫杉醇对肺癌干细胞的靶向性清除。我们在前期的研究显示，纳米载体是一种有望靶向清除CSCs的手段，由于纳米载体具有改善药物的性质、靶向递送和克服CSCs外排泵的特点。

“上海市脑卒中预防与救治服务体系”建设在推进过程中，也遇到了很多问题。马昕说，比如存在医疗机构之间发展水平和救治能力的差距、市中心和远郊的区域医疗资源配备不均衡等问题。他表示，对于这些问题，将在体系后期建设中研究解决。

尽管紫杉醇对肺癌具有很强的活性，但其在水中的溶解度很低。纳米载体有望改善化疗药物的水溶性。Abraxane就是一个例子，它可以显著增加癌症中的药物浓度。我们的研究使用由美国食品和药物管理局（FDA）批准的商用聚乳酸聚合物制成的纳米载体作为药物递送系统，以增加紫杉醇的溶解度及其对肺癌干细胞的靶向性。此外，CD133核酸适体在保证NPac-CD133对CD133肺癌细胞的靶向性方面起着关键作用。首先，我们使用流式细胞术和HPLC证明N-Pac-CD133能够有效结合CD133肺癌干细胞。在细胞结合后，与非靶向N-Pac和紫杉醇相比，N-Pac-CD133在CD133肺癌细胞中具有增强的细胞毒性，但在CD133肺癌细胞中没有。我们观察到，与N-Pac和紫杉醇相比，N-Pac-CD133 能更有效地减少肿瘤球数量和CD133肺癌干细胞的百分比，这表明N-Pac-CD133能更好地消除CD133肺癌干细胞。我们的结果和前期结果一致：靶向CSCs的纳米载体能显著减少肿瘤干细胞的数量。相反，N-Pac和紫杉醇增加了肿瘤球的数量和CD133肺癌干细胞的百分比。综上所述，数据表明N-Pac-CD133 对CD133肺癌细胞的选择性毒性。据我们所知，这是我们首次利用CD133靶向纳米载体实现对紫杉醇靶向递送，实现对肺癌干细胞的靶向杀伤。

民办非营利性医疗机构聘用的会计人员由机构自主设定门槛，大部分财务人员业务能力低，不具备上岗资格，财务处理不规范，专业培训缺乏业务主管部门和财政部门的重视和支持，影响了医疗改革政策研究的分析与决策依赖的数据信息质量。

体内实验显示，N-Pac-CD133对小鼠肿瘤的抑制效果最好，肿瘤体积抑制率达到了92%，显著强于NPac和紫杉醇的肿瘤抑制效果。在治疗终点时，我们取小鼠肿瘤并对肿瘤体质量进行称量，N-Pac-CD133治疗组和其他治疗组相比，肿瘤体质量显著减小。小鼠的体内数据显示：紫杉醇治疗后对小鼠毒性较大，而紫杉醇纳米载体组能显著减小对小鼠的体内毒性，我们的结果和别人取得的结果一致。

本研究利用纳米载体实现了对肺癌干细胞的靶向递送药物，CD133是靶向肺癌干细胞特异性输送的一个有希望的靶点。N-Pac-CD133能有效地将紫杉醇传递给CD133肺癌干细胞，并对CD133肺癌干细胞产生特异性毒性。N-Pac-CD133提供了靶向肺癌干细胞的一种有希望的治疗方法。