云南小粒咖啡花多糖提取工艺优化及其抗氧化活性分析

沈晓静，黄璐璐，聂凡秋，王 青，杨俊滔，颜成慧，姜薇薇,

（1.云南农业大学理学院，食品科学技术学院，云南昆明 650201；2.云南省天然药物药理重点实验室，昆明医科大学，云南昆明 650500；3.隆阳区坝湾民族中学，云南保山 678000）

咖啡为茜草科（Rubiaceae）咖啡属（Coffea）植物，主要分布在南美、中美洲、非洲和亚洲等国家，全球超过80个国家种植[1]。根据《中华本草》记载，咖啡具有醒神、利尿、健胃的功效，主治精神倦怠、食欲不振，常作为醒神、利尿和健胃药使用。现代研究表明，咖啡中含有生物碱、酚酸类、黄酮类、萜类等多种活性成分，具有肝脏保护、神经保护、抗氧化、抗糖尿病等多种药理活性[2-3]。

我国咖啡种植以小粒咖啡为主且99%以上分布在云南。云南小粒咖啡内含物质丰富，除咖啡因、绿原酸、葫芦巴碱等成分外，还含有包括mascarosides I～II[4]，paniculoside VI[4]、cofaryloside I[4]、villanovane Ⅰ[4]、caffarolides A～H[5]、caffruenol A-B[6]、caffruones A-D[6]和caffruolide A-B[7]等在内的一些新型萜类化合物。其中，caffarolides C、D和F被证实具有一定的体外激活血小板聚集活性[5]；caffruenol AB和caffruolide A-B具有抑制脂多糖诱导的264.7巨噬细胞NO产生的作用[7]。随着对咖啡的深入研究，咖啡的附加值不断提高。近年来，基于咖啡副产品中含有丰富的酚酸、类黄酮、萜类、生物碱等生物活性成分，可作为抗氧化、保护肝脏和神经等天然可持续活性成分来源，使得咖啡副产品的研究越来越受到研究者的关注[8-10]。Campa等报道了咖啡叶中含有酚类化合物[11]；Chen对咖啡叶中丰富的生物碱、黄酮、酚酸、萜类等的化学成分和抗氧化、抗炎、抗菌等药理活性进行了综述[12]，并研究了咖啡叶加工方式和叶龄对其化学成分和活性的影响[13]。另外，付晓萍等[14-15]发现云南小粒咖啡果皮的粗提物对受损人脐静脉内皮细胞有一定的保护和恢复作用，还具有潜在的抗氧化效果，并发现其中的主要花青素为矢车菊素-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3-芸香糖苷。

咖啡花作为咖啡种植产业中的主要副产物通常被丢弃。然而，已有的研究发现咖啡花化学成分丰富，Stashenko等[16]采用GC-MS分析了小粒咖啡花中的挥发和半挥发成分成分，结果共确定了150个化合物，以正十五烷含量最高，香叶醇次之。此外，Nguyen等[17]对咖啡花中的活性成分进行了研究，结果发现咖啡花中酚类化合物含量高，因此咖啡花可作为获取天然抗氧化活性成分的原料。另外，咖啡花中还含有咖啡因、葫芦巴碱。咖啡因具有降低患神经退行性疾病的风险[18-19]；葫芦巴碱则可预防糖尿病和肾损伤，同时还具有治疗神经退行性疾病的作用[20-21]。Pinheiro等[22]通过HPLC分析了不同干燥和提取方式下咖啡花中的葫芦巴碱、绿原酸、没食子酸和咖啡因4种活性成分的含量，其中以咖啡因和葫芦巴碱含量最高；并采用ABTS和DPPH实验评估了抗氧化活性，证实了咖啡花具有抗氧化活性并可作为制作茶饮料潜在的原料。目前对咖啡花的研究报道尚少，但从已有的报道可以看出，咖啡花作为潜在的生物活性化合物来源，具有广阔的应用前景。

多糖（polysaccharides）是由10个以上单糖经糖苷键结合而成的大分子化合物，广泛存在于动物、植物和微生物中。多糖结构复杂，具有不同的构象和相对分子质量，以及链内和链间氢键的二级结构。现代研究表明，多糖具有抗氧化[23-24]、抗衰老[25]、免疫调节[26]、抗炎[27]、抗肿瘤[28]等药理活性。多糖的生物活性与其纯度、化学结构、溶解度等有关。近年来，多糖的生物活性成为天然药物的研究热点，也是发掘新型药物和开发功能性食品的渠道，因此多糖在医药领域和食品领域具有重要地位。我国云南是咖啡种植的主要产区，咖啡花具有潜在的开发价值，但是目前对云南咖啡花的开发研究较少，咖啡花潜在的价值未能挖掘。因此本文以云南小粒咖啡花为探究对象，开展对其活性多糖的研究，旨在深入挖掘云南小粒咖啡的综合利用价值。

本文以多糖得率为评价指标，对采自云南省保山市的咖啡花进行多糖提取工艺的优化及其抗氧化能力进行测定，为进一步的开发具有生物活性的多糖提供基础数据，并为进一步开发和研究云南小粒咖啡和提高其附加值提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

咖啡花 云南省保山市；无水乙醇 天津化学试剂有限公司；蒽酮 纯度98.0%，国药集团化学试剂有限公司；浓硫酸、盐酸 重庆川东化工有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、芦丁 纯度98.0%，上海瑞永生物科技有限公司；水溶性维生素E 纯度98.0%，合肥博美生物科技有限公司；六水合三氯化铁 分析纯，西陇科学股份有限公司；过硫酸钾 分析纯，天津市大茂化学试剂厂；PBS缓冲液、醋酸钠缓冲液 厦门海标科技有限公司。

FA2104N型电子天平、722-分光光度计 上海箐华科技有限公司；KQ-250DB超声仪、SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限公司；旭曼-1000Y多功能粉碎机 永康市铂欧五金制品有限公司；800电动离心机 金坛市富华仪器有限公司；VFD-3000真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 咖啡花多糖的提取 参考郑婷婷等[29]的方法，并加以修改。将采自云南保山市的咖啡花在室温下阴干后，采用粉碎机粉碎并过80目筛后备用。称取咖啡花粉末2.0 g，加入20.0 mL纯水，浸泡30 min，40 ℃下100 W超声30 min，冷却至室温，经真空抽滤后保留滤液。在滤液中加入乙醇至浓度为80%进行沉淀，静置12 h。4000 r/min离心10 min后弃去上清液，沉淀加水溶解后-80 ℃下冻干，得粗多糖。配制5 mg·mL-1的咖啡花多糖溶液，备用。

1.2.2 多糖标准曲线的制备和咖啡花多糖含量的测定 参考蒽酮-硫酸法[30]绘制葡萄糖标准曲线。分别配制0.0、25.0、50.0、100.0、150.0和200.0 μg/mL葡萄糖标准溶液。精密吸取不同浓度的上述葡萄糖标准溶液1.00 mL，加入1.00 mL纯水，置于25 mL具塞试管。加入5.0 mL 2.1 mg·mL-1蒽酮-硫酸溶液摇匀，冰水浴冷却，沸水浴加热7 min，迅速置于冰水浴中冷却至室温。以去离子水作为空白对照，在625 nm处进行比色测定吸光度A。以无水葡萄糖含量为横坐标（0.0、25.0、50.0、100.0、150.0、200.0 μg），吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得标准曲线方程为：Y=0.0051X-0.0092（R2=0.9970）（式中：Y为吸光值，X为葡萄糖量，μg）。

精密吸取一定体积上述配制的5 mg/mL的咖啡花多糖溶液于25 mL具塞试管，加入纯水补至2.00 mL。加入5.0 mL 2.1 mg·mL-1蒽酮-硫酸溶液摇匀，冰水浴冷却，沸水浴加热7 min，迅速置于冰水浴中冷却至室温。以去离子水作为空白对照，在625 nm处进行比色测定吸光度A。根据葡萄糖标准曲线方程计算咖啡花多糖得率，每个样品重复3次，结果以平均值表示，计算公式如下：

式中：X为V体积咖啡花多糖溶液中多糖含量，μg；V为多糖溶液测定的体积，mL；5为配制的咖啡花多糖溶液浓度5 mg·mL-1；m1为冻干咖啡花粗多糖总质量，g；ms为称取咖啡花样品的质量，g。

1.2.3 单因素实验 在超声辅助提取咖啡花多糖的过程中，影响多糖得率的重要因素主要有超声温度、超声时间、液料比、超声功率、浸泡时间和醇沉浓度，分别对各个因素进行试验。

超声温度选取40、50、60、70、80 ℃五个水平；超声时间选取30、60、90、120、150 min五个水平；液料比10:1、15:1、20:1、25:1、30:1 mL/g五个水平；超声功率选取100、125、150、175、200 W五个水平；浸泡时间选取30、60、90、120、150 min五个水平；乙醇浓度选取75%、80%、85%、90%、95%五个水平，分别进行单因素实验。当筛选其中一个参数时，其余因素分别为：超声温度40 ℃、超声时间30 min、液料比10:1 mL/g、超声功率 100 W、浸泡时间30 min以及醇沉浓度80%。

1.2.4 响应面优化试验 根据Box-Benhnken试验设计原理，以咖啡花多糖得率为响应变量，从单因素试验结果中选取3个多咖啡花多糖得率影响最大的因素，见表1。以咖啡花多糖得率为指标优化超声温度、超声时间和超声功率。

表1 响应面分析因素和水平Table 1 Response surface analysis factors and levels

1.2.5 抗氧化能力实验

1.2.5.1 DPPH自由基清除实验 参考文献[31]描述的方法进行DPPH自由基清除实验。取3.9 mL 0.075 mmol/L DPPH反应液与100 μL不同浓度多糖溶液混合。室温下暗处反应30 min，于515 nm下分别测量吸光值，以芦丁为阳性对照，DPPH自由基清除率计算式为：I%=[（A0–As）/A0]×100（式中：As为样品溶液的吸光度；A0为未加样品溶液的吸光度），抗氧化活性以50%抑制率（IC50）表示。

1.2.5.2 ABTS+自由基清除实验 参考文献[32]描述的方法进行ABTS+自由基清除实验。分别取2 mL的多糖溶液加入到2 mL ABTS+自由基溶液中，均匀混合后，室温反应6 min，测定734 nm下紫外吸收，芦丁为阳性对照。ABTS+自由基清除能力计算公式如下：I（%）=[（A0–As）/A0]×100（式中：As为样品溶液的吸光度；A0为未加样品溶液的吸光度）标准曲线是通过测定不同浓度Trolox标准溶液绘制（I%=0.0247C-0.0046，R2=0.9937），样品的ABTS抗氧化活性表示为mmol Trolox/g。

1.2.5.3 FRAP法 参考文献[33]描述的方法进行FRAP抗氧化能力测定。取5.0 mL TPTZ、5.0 mL 20 mmol/L FeCl3和50 mL醋酸钠缓冲溶液（300 mmol/L，pH3.6）配制成FRAP工作液；100 μL样品与300 μL水和3.0 mL FRAP工作液混合，放置于37 ℃的水浴锅中反应30 min；于595 nm下测定吸光度。以FeSO4为标准品制作标准曲线（A=0.572C-0.008，R2=0.9974），芦丁为阳性对照，根据标准曲线计算还原能力，以mmol FeSO4/g多糖表示。

1.3 数据处理

所有试验均重复三次，取平均值。采用Design Expert 8.0.6软件进行响应面试验设计与分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

单因素实验结果如图1所示。超声温度对咖啡花多糖得率的影响：超声温度40～80 ℃，多糖得率为1.0048%～1.7982%。在40～70 ℃范围内，咖啡花多糖得率随超声温度的升高而逐渐升高，至70 ℃时达到最大，超过70 ℃后得率开始下降。这可能是由于在高温条件下咖啡花多糖的结构遭到破坏而造成多糖得率下降，这在文献[29,34-35]也有相似报道。超声温度选择为70 ℃。

图1 单因素实验结果Fig.1 Results of single factor experiments

超声时间对咖啡花多糖得率的影响：超声时间30～150 min，多糖得率为1.0369%～1.5853%，多糖得率随超声时间的增加而升高，至90 min时达到最大，90 min后，随超声时间的增加，得率开始下降。这是由于短时间的超声提取不利于多糖的充分溶解，而长时间的超声提取又会使多糖降解反而导致得率下降，这在文献[29,34-35]也有相似报道。因此，超声时间选择为90 min。

液料比对咖啡花多糖得率的影响：料液比对多糖得率的影响较小，液料比10:1～30:1 mL/g时多糖得率为1.1790%～1.3357%。多糖得率随液料比的升高而升高，至25:1 mL/g时达到最大，25:1 mL/g后，随液料比的升高，得率反而下降。溶剂较少会导致多糖不能充分的溶出而使多糖得率较低；较多的溶剂又会使多糖溶解而不易沉淀析出，同时也会因溶剂吸收超声波辐射而导致得率降低，这在文献[29,34-35]也有相似报道。考虑到液料比对得率的影响较小，为了节省试剂用量，因此，液料比选择为10:1 mL/g。

超声功率对咖啡花多糖得率的影响：超声功率选取100～200 W，多糖得率为1.1185%～1.8583%，多糖得率随超声功率的增大而升高，至175 W时达到最大，175 W后，随超声功率的增大，得率反而下降。超声功率增加可以有效地破坏细胞和组织使多糖溶解于溶剂中，因此增大超声功率有利于多糖的析出；但是，较大的超声波所产生的破碎效应和热效应同时会增加咖啡花中的杂质溶出，热效应又使多糖成分破坏从而引起多糖得率降低，这在文献[36-37]也有相似报道。因此，超声功率选择为175 W。

浸泡时间对咖啡花多糖得率的影响：浸泡时间对多糖得率的影响较小，浸泡时间30～150 min，多糖得率为1.1827%～1.4609%。30～90 min范围内，多糖得率随浸泡时间的增加而升高，至90 min时达到最大，90 min后，随浸泡时间的增加，得率略有下降，且趋于平缓。浸泡时间的延长可利于多糖在超声过程中的析出，并减少能耗。但是过长的浸泡并不能带来较高的得率，过长的浸泡也会使其他成分析出影响多糖得率。这与文献[38]报道相似。考虑到浸泡时间的影响较小，为了节省时间，浸泡时间选择为30 min。

醇沉浓度对咖啡花多糖得率的影响：醇沉浓度对多糖得率的影响较小，醇沉浓度75%～95%，多糖得率为0.9703%～1.2806%。多糖得率随乙醇浓度的升高而升高，至85%时达到最大，85%后，随乙醇浓度的升高，得率反而下降。水提醇沉是利用多糖不溶于醇的性质而使其沉淀析出。当随着乙醇的加入量增加，多糖因不溶于乙醇而沉淀析出，得率增大，当醇沉浓度超过85%以后，并不能提高多糖得率，反而造成试剂的浪费。这与文献[38]报道相似。为简化操作，本文采用直接加入乙醇调节醇浓度的方法进行沉淀，同时，由于80%与85%多糖得率差别不大，但可节约试剂减少浪费。因此，醇沉浓度选择为80%。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验结果 超声温度、超声时间和超声功率影响较大，因此在上述单因素实验基础上，对超声温度、超声时间和超声功率三个条件进行响应面法优化，结果见表2。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface experiment

以多糖得率（Y）为考察响应指标，建立其与超声温度、超声时间和超声功率三个因素的回归模型，得到二次回归方程为：

2.2.2 方差的显著性检验 对上述回归模型进行显著性检验，结果见表3。

表3 多糖得率方差分析结果Table 3 Results of variance analysis of yield of polysaccharides

由表3方差分析结果得，总模型显著（P＜0.0001），该模型达到极显著水平，表明不同因素间的差异显著；根据回归方程一次项系数绝对值大小可知，各因素对总多糖得率的影响顺序为：A＞B＞C，即超声温度＞超声时间＞超声功率。失拟项P=0.5764＞0.05，失拟项检验不显著，说明未知因素对试验结果的影响较小，残项主要由随机误差引起，表明模型选择适当正确。AB的影响显著（P＜0.05），A2、B2、C2的影响极显著（P＜0.01），在整个模型中，模型中的调整系数R2Adj=0.9277，说明92.77%的响应值变化可以通过模型进行解释，决定系数R2=0.9684，表明模型可信度高，且模型与实验拟合良好，可用此模型进行分析与预测[39-42]。

2.2.3 响应曲面及等高线 各因素交互作用对咖啡花多糖得率影响的响应面图见图2。由超声温度和超声时间两者的交互作用可知，二者交互作用显著；当超声温度不变时，咖啡花多糖的得率随超声时间的增加先上升后下降；当超声时间不变时，咖啡花多糖得率随超声温度的升高先增大后减小。由超声温度和超声功率两者的交互作用可知，当超声温度不变时，咖啡花多糖的得率随超声功率的增加先上升后下降；当超声功率不变时，咖啡花多糖得率随超声温度的升高先增大后减小。由超声时间和超声功率两者的交互作用可知，当超声时间不变时，咖啡花多糖的得率随超声功率的增加先上升后下降；当超声功率不变时，咖啡花多糖得率随超声时间的升高先增大后减小。

图2 各因素交互作用对多糖得率影响的三维曲面和等高线Fig.2 Three-dimensional surface plot and contour map for the interactive effects of four extraction parameters on yield of polysaccharides

因此，以多糖得率作为评价标准，通过对超声时间、超声温度和超声功率三个条件的响应面法优化结果为：超声温度69.56 ℃、超声时间92.99 min和超声功率174.01 W，预测此条件下2.290%。根据实际情况操作选取超声温度69.5 ℃、超声时间93.00 min和超声功率175W、浸泡时间30 min、液料比10:1 mL/g和乙醇浓度80%进行4次平行试验，平均得率为2.292%±0.061%。基本接近试验所获得的理论值，表明预测值和真实值之间有很好的拟合性，因此本研究中利用响应面获得的优化工艺参数准确可靠[43]。

2.3 抗氧化能力实验结果

DPPH实验是一种高效、灵敏的植物抗氧化能力评价模型，被测样品的自由基清除能力与其潜在的提供质子能力相关；ABTS实验被广泛用于估计植物样品的抗氧化能力，其可以测试样品中的亲脂性和亲水性成分的抗氧化活性；FRAP法通过将Fe3+-TPTZ还原为Fe2+-TPTZ来评估天然产物的还原能力[44-45]。咖啡花多糖抗氧化实验结果见表4，咖啡花多糖对DPPH自由基、ABTS+自由基均表现出了一定的抗氧化活性，但与芦丁相比，其抗氧化活性较低。

表4 咖啡花多糖的抗氧化活性Table 4 Antioxidant activities of polysaccharides from coffee flowers

3 结论

本实验以云南小粒咖啡花为原料，采用超声辅助提取云南小粒咖啡花多糖，通过对超声时间、超声温度、液料比、超神功率、浸泡时间和醇沉浓度6个因素考察的基础上，发现超声时间、超声温度和超声功率对咖啡花多糖的提取具有重要的影响。再通过响应面优化超声时间、超声温度和超声功率，确定咖啡花多糖的最佳工艺条件为：超声温度69.5 ℃，超声时间93 min，超声功率175 W，液料比10:1 mL/g，浸泡时间30 min，乙醇浓度80%。该条件下多糖得率为2.292%±0.061%。该方法能有效提高咖啡花多糖的得率，同时缩短了提取时间和减少乙醇的使用量。抗氧化实验结果表明，咖啡花多糖显示弱抗氧化能力。本研究将为进一步的开展咖啡花多糖分离纯化以及活性功能研究提供参考，也将为咖啡的进一步开发利用提供理论依据和支撑。