心神宁片中十二个成分的含量测定及化学计量学分析

张 蕊，徐延昭，张 静，许保海*

（1.北京积水潭医院 中药房，北京100035；2. 中国食品药品检定研究院，北京100050）

心神宁片由君药炒酸枣仁、臣药茯苓、佐药栀子和六神曲、使药甘草组方，适用于肝血不足、阴虚内热、虚烦失眠的病患者[1]。方中酸枣仁养肝血、除虚烦、安心神、止盗汗，为君药；远志安心神、止惊悸、开智慧；茯苓定神志、保神守中，二者共为臣药；栀子开火郁、清心降火除烦，与酸枣仁相合，滋清并用，标本兼顾；神曲健胃和胃、消食化滞，与栀子共为佐药；甘草可调和药性、健脾和中为使药。诸药配伍合用，具有养血安神、清心除烦、健胃和胃之功效。心神宁片疗效显著，但其现行质量标准[1]仅以栀子苷为指标进行了含量测定，检索到与检验分析相关的文献中，也只对斯皮诺素进行了含量测定[2]。因此，建立一个全面便捷的质量评价方法，对心神宁片的质量进行综合评价具有重要的现实意义。本实验采用高效液相色谱联合一测多评法（HPLC-QAMS）测定15 批心神宁片样品中栀子新苷、山栀子苷、羟异栀子苷、栀子苷、西伯利亚远志糖A5、西伯利亚远志糖A6、远志酮Ⅲ、3, 6'-二芥子酰基蔗糖、斯皮诺素、6'''-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B 共12 种成分含量，并结合化学模式识别[3]、PLS-DA[4]和熵权优劣解距离法（EW-TOPSIS）[5]，通过SPSS 26.0 和SIMCA 14.1 统计软件对其质量进行综合评价，以期为心神宁片的质量控制提供新的思路。

1 材料

1.1 试药

对照品栀子苷（批号：110749-201919，含量：97.1%）、远志酮Ⅲ（批号：111850-202207，含量：95.8%）、3,6'-二芥子酰基蔗糖（批号：111848-202006，含量：96.5%）、斯皮诺素（批号：111869-202005，含量：94.8%）、酸枣仁皂苷A（批号：110734-201914，含量：96.0%）和酸枣仁皂苷B（批号：110814-201809，含量：96.2%）购于中国食品药品检定研究院；栀子新苷（批号：CFS201901，含量：98.0%）购于武汉天植生物技术有限公司；山栀子苷（批号：PRF9071641，含量：97.7%）、羟异栀子苷（批号：PRF9040843，含量：99.4%）、西伯利亚远志糖A5（批号：PRF9073003，含量：99.8%）、西伯利亚远志糖A6（批号：PRF9050843，含量：87.6%）、6'''-阿魏酰斯皮诺素（批号：PRF8010622，含量：99.3%）购于成都普瑞法科技开发有限公司；乙腈和磷酸为色谱纯，其余试剂选用分析纯；心神宁片（规格：0.25 g/片，批号：530277、530363、630144、630148、630149、630203、730085、730086、730087、730156，编号S1 ～S10，购于A 公司；批号：210901、210907、211205、220207、220208，编号S11 ～ S15，购于B 公司）。

1.2 仪器

Shimadzu LC-20A 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；AI203-IC 型电子天平（上海梅特勒-托利多仪器公司）；KQ-300DV 型超声波清洗器（广州颖汉科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Kromasil KR100-5C18色谱柱（ 250 mm× 4.6 mm，5μm ），柱温为30 ℃；检测波长为238 nm（0 ～ 24 min检测栀子新苷、山栀子苷、羟异栀子苷和栀子苷）[6-10]、320 nm（24 ～ 41 min 检测西伯利亚远志糖A5、西伯利亚远志糖A6、远志酮Ⅲ和3,6'-二芥子酰基蔗糖）[11-18]和204 nm（41 ～ 65 min 检测斯皮诺素、6'''-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A 和酸枣仁皂苷B）[19-20]；流 动 相 选 用0.05% 磷 酸（A）- 乙 腈（B），梯度洗脱（0 ～ 10 min，10.0%B；10 ～ 24 min，10.0% →25.0%B；24 ～ 41 min，25.0% →30.0%B；41 ～ 57 min，30.0% →37.0%B ；57 ～ 65 min，37.0%→10.0%B）；体积流量为1.0 mL/min；进样量为10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取栀子新苷、山栀子苷、羟异栀子苷、栀子苷、西伯利亚远志糖A5、西伯利亚远志糖A6、远志酮Ⅲ、3,6'-二芥子酰基蔗糖、斯皮诺素、6'''-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B 对照品，用70%甲醇制成折纯后质量浓度分别为0.178 mg/mL、0.394 mg/mL、0.712 mg/mL、2.390 mg/mL、0.768 mg/mL、0.232 mg/mL、0.296 mg/mL、0.810 mg/mL、0.326 mg/mL、0.198 mg/mL、0.152 mg/mL 和0.086 mg/mL 的混合对照品母液，再将母液用同一溶剂稀释20 倍制得混合对照品溶液（上述12 个对照品质量浓度分别为8.9 μg/mL、19.7 μg/mL、35.6 μg/mL、119.5 μg/mL、38.4 μg/mL、11.6 μg/mL、14.8 μg/mL、40.5 μg/mL、16.3 μg/mL、9.9 μg/mL、7.6 μg/mL 和4.3 μg/mL）。

2.2.2 供试品溶液的制备 取除去包衣的心神宁片，研成细粉，精密称取0.5 g，用70%甲醇超声处理30 min，放冷，70%甲醇定容至25 mL，摇匀，过滤，即得心神宁片供试品溶液。按质量标准[1]分别制备缺栀子、缺远志、缺炒酸枣仁的阴性供试品，再制备相应的阴性供试品溶液。

2.3 系统适用性实验

取混合对照品溶液及供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样检测，记录色谱流出图，见图1。图谱显示心神宁片供试品溶液中12 个成分在65 min内完成检测，均达到基线分离，拖尾因子符合《中国药典》标准要求；理论板数按栀子苷计应不低于6 500。

图1 HPLC 色谱图Fig. 1 HPLC chromatograms

2.4 多指标成分定量检测

2.4.1 线性关系考察 精密吸取混合对照品母液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 和5.0 mL，分别用同一溶剂定容至20 mL，摇匀制得6 个系列工作溶液，按“2.1”项下色谱条件进样检测，以12 个对照品质量浓度为横轴（X，μg/mL），峰面积（Y）为纵轴进行线性回归，结果见表1。

表1 心神宁片中各成分的线性关系Tab. 1 Linear regressionships of each analyte in Xinshenning tablets

2.4.2 精密度、稳定性及重复性试验 按“2.1”项下色谱条件，重复进样混合对照品溶液6 次，测得12 个成分峰面积的RSD 值依次为1.46%、1.19%、0.96%、1.53%、1.22%、0.71%、1.08%、1.24%、1.81%、1.86%、1.59%和1.16%，表明仪器精密度良好。取一份心神宁片（S1）供试品溶液，于制备后0、2、4、7、12、18 和24 h 进样，测得12 个分析物峰面积的RSD 值依次为1.13%、1.68%、0.82%、1.51%、1.36%、0.66%、1.18%、1.34%、1.67%、1.87%、1.31%、1.22%，表明心神宁片供试品溶液在24 h 内稳定。取心神宁片（S1）适量，按“2.2.1”项下方法制备心神宁片供试品溶液6 份，在“2.1”项下色谱条件进样分析，用外标法计算得12 个分析物的平均含量分别为0.496 mg/g、1.149 mg/g、1.969 mg/g、7.190 mg/g、2.352 mg/g、0.697 mg/g、0.853 mg/g、2.796 mg/g、0.981 mg/g、0.528 mg/g、0.323 mg/g、0.187 mg/g，RSD 值依次为1.26%、1.91%、0.73%、1.43%、0.91%、1.54%、1.29%、1.32%、1.21%、1.38%、1.61%、1.37%，表明方法重复性良好。

2.4.3 加样回收率试验 取心神宁片（S1）9份，研成细粉，每份精密称定0.25 g，分别加入混合对照品溶液（折纯后12 个成分质量浓度分别为0.124 mg/mL、0.291 mg/mL、0.496 mg/mL、1.785 mg/mL、0.589 mg/mL、0.176 mg/mL、0.213 mg/mL、0.701 mg/mL、0.252 mg/mL、0.137 mg/mL、0.083 mg/mL、0.047 mg/mL）0.8、1.0、1.2 mL，再按“2.2.2”项下方法制得加样供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件检测，得12个成分的平均加样回收率分别为97.73%、98.68%、99.49%、100.09%、98.86%、98.09%、99.21%、100.04%、98.21%、97.81%、96.74%、97.28%，RSD分别为1.59%、1.16%、1.10%、0.66%、1.49%、1.68%、1.01%、0.94%、1.43%、1.73%、0.96%、1.32%。

2.5 HPLC-QAMS 质量评价模式的建立

2.5.1 相对校正因子（f）的计算 以栀子苷为内参比物质，将“2.4.1”项下6 个系列浓度溶液分别进样，按照公式计算f，结果见表2。

式中峰面积用A 表示，质量浓度用W 表示，内参物和其它成分分别用k 和s表示。

表2 心神宁片中各分析物的相对校正因子

Tab. 2 Relative correctim factor of each analyte in Xinshenning Tablets

编号 栀子新苷 山栀子苷 羟异栀子苷 西伯利亚远志糖A5西伯利亚远志糖A6 远志images/BZ_48_1296_1078_1325_1115.png酮Ⅲ 3,6'-二芥子酰基蔗糖 斯皮诺素 6'''-阿魏酰斯皮诺素酸枣仁皂苷A酸枣仁皂苷B 1 2.138 1 0.763 0 0.659 1 0.533 9 1.371 1 1.088 1 0.503 9 0.909 1 1.675 7 3.220 9 5.037 1 2 2.132 6 0.761 6 0.658 0 0.549 4 1.369 2 1.088 5 0.489 6 0.896 5 1.725 5 3.222 4 5.038 2 3 2.152 4 0.760 5 0.659 3 0.547 1 1.363 5 1.086 5 0.491 4 0.893 7 1.740 8 3.185 5 4.974 0 4 2.062 0 0.771 2 0.661 9 0.551 1 1.317 8 1.093 0 0.494 4 0.911 1 1.748 1 3.218 0 5.061 6 5 2.137 9 0.777 0 0.643 9 0.558 2 1.369 9 1.085 4 0.483 8 0.917 3 1.775 6 3.227 7 5.010 6 6 2.117 9 0.770 0 0.654 8 0.551 7 1.352 9 1.088 2 0.490 3 0.908 5 1.746 6 3.218 2 5.064 2平均值 2.123 5 0.767 2 0.656 2 0.548 5 1.357 4 1.088 3 0.492 2 0.906 0 1.735 4 3.215 5 5.031 0 RSD/% 1.51 0.85 0.98 1.48 1.52 0.24 1.36 1.00 1.93 0.47 0.68

2.5.2 相对校正因子（f）耐用性考察 分别考察仪器及色谱柱、单位体积流量和柱温的改变对f 的影响，选用液相色谱仪（Shimadzu LC-20A 型和1260 型）和色谱柱（Kromasil KR100-5 C18柱、Agilent TC-C18柱和Waters Symmetry C18柱），流速：（1.0±0.2） mL/min，柱温：（30±5）℃等条件，取混合对照品溶液依法进样检测，结果仪器与色谱柱对所建立的f 无影响（RSD ≤1.78%）；单位体积流量对所建立的f 无影响（RSD ≤1.84%）；柱温对所建立的f 无影响（RSD ≤1.90%）。

2.5.3 色谱峰定位 在“2.1”项下色谱条件，对“2.2.1”项下混合对照品溶液进行检测，记录色谱峰保留时间，以栀子苷为参照色谱峰，采用相对保留时间值法对待测成分色谱峰进行定位，考察液相色谱仪（Shimadzu LC-20A 型和1260 型）和色谱柱（Kromasil KR100-5 C18柱、Agilent TC-C18柱和Waters Symmetry C18柱）对相对保留时间值（t）的影响，结果RSD ≤1.89%，表明采用相对保留时间值法可以对目标化合物色谱峰进行准确定位。

2.6 含量测定

取15 批心神宁片（S1 ～S15），依法制备心神宁片供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，分别运用外标法（ESM）和一测多评法（QAMS）法计算心神宁片中12 个成分的含量，见表3。先采用相对平均偏差考察每一批次各成分用ESM 和QAMS所得结果之间的差异，结果各成分两种方法所得含量RSD 值均小于2.0%，表明每一批次各成分两种方法所得结果无明显差异。所建立的QAMS 法可用于心神宁片中12 个成分的含量测定。

2.7 心神宁片化学计量学质量分析的建立

2.7.1 聚类分析（CA） 将表3 中QAMS 法计算结果导入SPSS 26.0，采用平均联接（组间）、以欧氏距离为测度的方法进行系统聚类，得图2。结果显示，当间距为15 时，15 批心神宁片样品聚为3 类，样品S3、S4、S5、S6、S1 和S2 聚为一类，样品S7、S9、S8 和S10 聚为一类，样品S12、S15、S11、S14 和S13 聚为一类。

图2 15 批心神宁片样品聚类树状图Fig. 2 Cluster tree of 15 batches of Xinshenning tablets samples

2.7.2 主成分分析（PCA） 将表3 中QAMS 法测定结果导入SPSS 26.0 统计软件采用降维的方式对主成分进行提取，得各主成分特征值和方差贡献率（表4）及成分矩阵表（表5）。由表4 可知有2 个主成分特征值大于1，累积方差贡献率为85.746%。表5 可以看出第一主成分来自栀子新苷、羟异栀子苷、西伯利亚远志糖A5、西伯利亚远志糖A6、3,6'-二芥子酰基蔗糖、6'''-阿魏酰斯皮诺素和酸枣仁皂苷B 等成分的综合；第二主成分来自山栀子苷、栀子苷、远志酮Ⅲ、斯皮诺素和酸枣仁皂苷A 的信息。同时应用SIMCA 14.1 建立PCA 模型，15 批心神宁片样品PCA 得分图见图3，共提取出2 个主成分R2X 为0.857（＞0.5），所建立的模型稳定性较高。从图3 可以看出，PCA 与CA 分析结果一致，15 批心神宁片呈现一定的分类趋势。

图3 心神宁片PCA 得分图Fig. 3 PCA score chart of Xinshenning tablets

表3 心神宁片中12 个分析物含量测定结果（mg/g，n = 3）Tab. 3 Determination results of 12 analytes in Xinshenning tablets（mg/g，n = 3）

表4 心神宁片中主成分方差分析Tab. 4 Analysis of variance of principal components in Xinshenning tablets

表5 心神宁片中12 个分析物的成分矩阵表Tab. 5 Composition matrix table of 12 analytes in Xinshenning tablets

2.7.3 偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA） 将表3 中QAMS 法含量数据导入SIMCA 14.1，启动PLS-DA 程序，提取到2 个主成分，得PLS-DA 得分模型（图4），结果模型拟合度较好、稳定可靠、预测能力强（累积解释能力参数R2X＝0.886、R2Y＝0.914，预测能力参数Q2＝0.879）。对建立的PLSDA 模型进行置换检验200 次（图5），结果建立的PLS-DA 模型结果可靠（R2＝0.032 4）；构建的PLS-DA 不存在过度拟合（Q2拟合直线Y 轴截距为-0.379），可有效判别分析15 批心神宁片的质量差异。经PLS-DA 模型拟合分析生成VIP 图（图6），结果VIP ＞1 的有5 个成分，分别为栀子苷（VIP =1.905 0）、3,6'-二芥子酰基蔗糖（VIP = 1.293 0）、羟异栀子苷（VIP = 1.217 0）、西伯利亚远志糖A5（VIP =1.132 0）、山栀子苷（VIP = 1.044 0），可作为影响心神宁片产品质量的差异标志物。

图4 15 批心神宁片样品的PLS-DA 模型得分图Fig. 4 Score chart of PLS-DA model for 15 batches of Xinshenning tablets

图5 15 批心神宁片样品PLS-DA 置换检测结果图Fig. 5 Figures of PLS-DA replacement detection results for 15 batches of Xinshenning tablets

图6 15 批心神宁片样品的VIP 图Fig. 6 VIP images for 15 batches of Xinshenning tablets

2.8 熵权优劣解距离法（EW-TOPSIS）分析

2.8.1 归一化处理 心神宁片中的12 个成分属于越大越优型指标。根据公式：

对心神宁片中12 个成分一测多评法含量检测结果数据进行归一化处理，见表6。

表6 各指标归一化处理结果Tab. 6 Results of normalization treatment for each index

2.8.2 加权决策矩阵的构建 以PLS-DA 分析中影响心神宁片化学成分差异的VIP 值作为各指标权重（Wj），将归一化后数据与各指标Wj相乘得加权决策矩阵［Z ＝（x*ij×Wj）m×n］，见表7。

2.8.3 贴近度的计算及评价 根据表7 得到最优方案Z+＝max（ Z1，Z2，…Zm）和最劣方案Z-＝min（ Z1，Z2，…Zm）得Z+＝max（ 0.461 0、1.044 0、1.217 0、1.905 0、1.132 0、0.726 0、0.830 0、1.293 0、0.894 0、0.540 0、0.321 0、0.474 0），Z-均为0。再依据以上方案，按照公式计算每一批次心神宁片样品与正理想解距离（Di+），与负理想解的距离（Di-），以及最优解的欧氏贴近度（Ci），结果见表8。

表7 加权矩阵Tab. 7 Weighting matrix

表8 心神宁片质量评价排序Tab. 8 Relative ordering of quality evaluation of Xinshenning tablets

3 讨论

3.1 供试品溶液制备

本试验在制备供试品溶液时，先筛选了提取溶 剂：50% 甲 醇[9,16]、70% 甲 醇[7,11-15,17]、100% 甲醇[5-6,10,18]和70%乙醇[8,19-20]，结果发现70%甲醇提取时，心神宁片中的12 个成分的提取率较高，各成分响应值最大。进而以70%甲醇为溶剂，对提取方式（超声和加热回流）及时间（20、30、40、50、60 min）进行考察，结果发现70%甲醇超声提取30 min时，12 种成分的提取率最高，杂质干扰最少，故以70%甲醇超声提取30 min 为心神宁片供试品溶液制备方法。在考察料液比时，参考相关文献[2]，考察了称样量为0.5 g 时，溶剂加入量为10、20、25、30、50 mL 时各成分的响应值、杂质干扰等因素，最终以0.5 g ∶25 mL 为最佳料液比。

3.2 QAMS 法与化学计量学方法及结果评价

采用QAMS 法和ESM 法对15 批心神宁片中的12 种成分进行定量分析检测，结果显示两种方法无差异，说明所建立的QAMS 法可用于心神宁片中多指标含量的同时检测，解决了部分对照品不稳定、检验成本过高等因素导致的常规多指标质控模式难以普及应用等不足；利用多种化学模式对QAMS 法结果数据进行分析，能够更加客观地反映该制剂的内在质量，聚类分析和主成分分析结果显示，15 批心神宁片样品聚为3 类，不同生产企业所生产的心神宁片质量差异较大，同一生产企业样品间质量差异较小，但也存在一定的批间差异；偏最小二乘法-判别分析结果显示栀子苷、3, 6'-二芥子酰基蔗糖、羟异栀子苷、西伯利亚远志糖A5 和山栀子苷是影响心神宁片产品质量的差异标志物。表明本研究所建立的方法对稳定心神宁片产品质量具有一定指导意义，同时中成药复方制剂产品质量差异主要取决于所用原药材的产品质量以及制剂生产过程质量控制，提示生产厂家根据制剂生产的实际情况结合所建立的质控和评价方法，完善原药材内控标准以及生产过程控制参数，以稳定产品质量。

4 结论

本实验采用高效液相色谱联合一测多评法对心神宁片中12 个成分含量进行了同时测定，所建立的方法操作便捷，结果准确可靠，首次建立了心神宁片多指标成分质控模式，通过对多指标成分含量测定结果的化学计量学分析，发掘了影响心神宁片产品质量的主要潜在标志物，同时采用EW-TOPSIS 建立了心神宁片产品质量优劣评价方法，为心神宁片的质量控制提供了新思路。