青海藜麦育成品种种子纯度的SSR鉴定

高 森，左皓南，张书苗，陈翠萍,2，闫殿海,2，刘 洋,2*

(1.农业农村部植物新品种测试(西宁)分中心，青海 西宁 810016；2.青海省农林科学院作物所，青海 西宁 810016)

藜麦(ChenopodiumquinoaWilld.)原产于南美洲安第斯山脉的哥伦比亚、厄瓜多尔、秘鲁等山区，最适宜生长在海拔高度为3000-4000m的高原或山地地区[1]；藜麦具有耐旱、耐寒、耐盐碱等优良种植特性，种植范围非常广泛[2,3]。藜麦种子含有多种必需氨基酸、矿质元素、蛋白质、膳食纤维等营养成分及黄酮和多酚等生理活性物质[4,5]，具有降血糖、血压、血脂和抗氧化及抗衰老作用，能提高机体应激能力[6]，改善血脂代谢、预防疾病、抑制肥胖及调节免疫，在降低心血管疾病患病风险和维持膳食营养均衡等方面也具有良好的健康促进作用[7,8]，美国国家航空航天局将藜麦列为外太空的理想粮食[9]。随着人们生活水平的提高和保健意识的增强，对粮食的多样性、营养性、安全性和健康性要求大幅提升，因此对藜麦的需求量也逐年大幅增加[10,11]，这也导致藜麦的种植面积逐年增加，仅青海省2017年-2019年藜麦种植面积达到4900hm2，历年平均3450hm2[12]。

种子纯度是种子质量的重要指标，因此保证种子的纯度是确保其品质优良而畅销市场的关键。《农作物种子检验规程》规定的种子纯度鉴定方法分为田间小区种植鉴定法、种子形态鉴定法和幼苗鉴定法[13]，但因田间种植的周期长、形态标记数量浩繁，且数量性状容易受外界环境和检测人员经验的影响，制约了纯度鉴定的准确性，而随着分子辅助育种技术的快速发展，DNA分子标记可实现快速、准确鉴定种子纯度，也使之成为田间鉴定的有效辅助手段。因SSR分子标记具有共显性、重复性好、多态性高，不受外界环境、组织与发育情况等条件影响的优点[14,15]，已广泛应用于水稻、油菜、大豆、棉花等传统作物的种子纯度鉴定[16-19]，目前藜麦的 SSR 分子标记应用于种质资源遗传多样性分析已见报道[20-22]，但尚未见用SSR分子标记技术应用于藜麦种子纯度的报道，因此建立高效准确快速的藜麦种子纯度鉴定方法是必要的。

本试验以青海目前已审定推广的青藜1号、青藜2号和青白藜1号为实验材料，从前期已筛选出的18对SSR引物中最终筛选出稳定性高、特异性强的SSR引物对藜麦品种进行差异性分析，建立适用于藜麦品种纯度鉴定的SSR体系，为藜麦种子纯度鉴定提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本研究所采用的供试材料均由青海省农林科学院作物育种栽培研究所提供(表1)。

表1 实验材料名称Table.1 The Name of quinoa material

1.2 实验方法

1.2.1DNA提取

用CTAB法提取DNA。每品种随机选取200株，选取每株真叶为实验材料。提取的DNA存于-20℃备用。

1.2.2 PCR扩增程序

PCR反应程序为：94℃3min，94℃30s，60℃30s，72℃1min 9个循环，每个循环减0.5℃，94℃30s，55℃45s，72℃1min 2个循环；72℃10min；4℃保存。

1.2.3 电泳检测

6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染染色，NaOH溶液显色，读带并记录结果。

1.2.4 数据处理

藜麦种子纯度=(具有特征条带的样本数/鉴定的样本总数)×100%。

由于每个品种(系)利用2个引物检测，每个品种(系) 对应的所有检测引物的纯度平均值，认为是该藜麦品种(系)的纯度。

2 结果与分析

2.1 SSR引物的筛选

本试验利用实验室前期已筛选出的18对引物[23]，再次筛选并进行重复性检验和群体检验后，确定带型清晰、稳定性好的引物作为检测藜麦种子纯度的特异引物。最终筛选出2对引物191112R09和KCAA078用于藜麦种子纯度分析，引物信息见表2。

191112R09和KCAA078在群体中具有明显的多态性(图1)，条带清晰明亮，带型差异明显，多态性片段大小为150-250bp。进行不同批次的PCR扩增和不同批次的试验试剂均得到扩增产物电泳条带。

2.2 藜麦种子纯度鉴定

利用筛选出的KCAA078和191112R092这2对引物分别鉴定了青藜1号、青藜2号和青白藜1号3个品种各2个年份的种子的纯度，均得到条带清晰、稳定的图谱，部分群体验证的结果见图2所示。

综合实验结果(见表3)，青藜1号-2014、青藜1号-2015的种子纯度是：86.61%和98.61%；青藜2号-2019、青藜2号-2020的种子纯度是97.00%和89.00%；青白藜1号-2019、青白藜1号-2020的种子纯度是94.50%和86.50%，年度间种子纯度有8%-12%差异。

表3 藜麦种子纯度鉴定结果Table.3 The purity identification of quinoa seeds

3 结论与讨论

由于不同作物品种间遗传组成不同，基因组DNA中简单重复序列的重复次数有差异。这种差异可通过PCR扩增及电泳方法进行检测，从而能够区分不同品种。许多研究表明，利用DNA指纹鉴定技术鉴定品种真实性和纯度的方法是可行的，检测结果是准确的[24-25]。

当选择多对引物来鉴定藜麦种子纯度，不仅可以有效区分不同基因型的藜麦种子，而且可以把混杂在其中的其他品种的种子区分开来，本着经济节约的原则，本实验采用两对引物(KCAA078和191112R092)进行组合鉴定藜麦种子纯度。

青藜1号-2014和青藜1号-2015的种子纯度分别为86.61%、98.61%，这一结果可能是2015年种子是经过提纯的结果，尚需进一步进行验证；青白藜1号-2019和青白藜1号-2020的种子纯度与青藜2号-2019和青藜2号-2020种子纯度均呈现年度下降的趋势；这一结果可能是因为是藜麦是常异交作物且种子田没有采取严格的隔离措施，出现天然异交而导致的。

青藜2号-2019、青藜2号-2020在2对引物中均表现为两种特异条带，我们认为青藜2号可能存在两种特异性条带，并非是品种的混杂，而其相关的田间鉴定将在今后开展进一步的研究。

因此，利用SSR分子标记技术进行纯度鉴定这种鉴定方法适用于藜麦育成品种种子纯度的快速鉴定。