呼吸重症监护室耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分子流行病学调查

曾军 孟千琳 李奇 马春兰 郑鹏城 李万成

金黄色葡萄球菌是一种最常见临床致病菌，常引起社区获得性或医院获得性感染，自耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)发现以来，由其引起的感染迅速在全球流行[1]。近年来，虽然MRSA检出率表现出逐渐下降趋势，但仍然是最主要的一类耐药致病菌。

感染是ICU患者最常见并发症，也是发展为脓毒症的必需因素；据EPIC III报道，约57%的ICU患者合并有可疑或确诊感染，感染后病死率达到30%，其中MRSA是最常见的耐药致病菌之一[2]。

因此，对医院RICU病房MRSA感染的耐药特征、分子分型调查和分析，有助于提供针对性的治疗策略，提高RICU病房病人的临床预后，现将本文研究结果报告如下。

资料与方法

一、材料

取成都医学院第一附属医院RICU病房2017年1月至2020年12月自病人的痰标本、肺泡灌洗液、血液、尿液等标本中分离出的52株MRSA作为受试对象，均符合MRSA感染诊断标准《医院感染诊断标准(试行)》[3]。本研究经成都医学院第一附属医院医学伦理委员会审查批准。

二、细菌分离及鉴定

先通过VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定药敏分析仪鉴定为金黄色葡萄球菌，质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC25923。MRSA的鉴定采用头孢西丁纸片扩散法，参照美国临床与实验室标准协会(CLSI)M100-S30 文件执行。

三、药敏实验

采用琼脂稀释法：将0.5麦氏浊度单位的菌悬液，用CAMHB肉汤将初始接种物1 ∶100倍稀，菌液浓度约为1×106 CFU/mL，用多点接种仪吸取0.05 mL接种于含系列稀释抗菌药物CAMHB肉汤，35℃孵育16～20h后观察结果，计算抗菌药物MIC50、MIC90。药敏结果判断参照美国CLSI M100-S30判断标准，所用15种抗生素包括苯唑西林、头孢唑林、呋喃妥因、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑(复方新诺明), 红霉素、克林霉素、利福平、利奈唑胺、庆大霉素、四环素、替加环素、替考拉宁、万古霉素、左氧氟沙星、莫西沙星。

四、分型检测方法

多位点序列分型(MLST)联合SCCmec分型方法进行分子分型。使用PubMLST数据库网站(https://pubmlst.org/)推荐引物，PCR扩增7个管家基因(arc C、aro E、glp F、gmk、pta、tpi和yqi)，扩增片段送生工生物测序，测序结果登录PubMLST数据库经过序列比对，以获取等位基因号，最终确定MLST分型。SCCmec基因分型使用5对特异性引物，对每株MRSA基因组DNA进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，鉴定五种类型(I、II、III、IV、V), 其余判定为未定型(NT),具体方法参考文献[4-5]。

五、统计学方法

结 果

一、标本来源

30.76% MRSA标本来源中痰标本，占比最高；21.15%来源于肺泡灌洗液。呼吸系统是MRSA的主要来源，其余来源(见表1)。

表1 RICU病房52株MRSA标本来源

二、药敏试验结果统计

MRSA对苯唑西林、头孢唑林及红霉素的耐药率高，分别达到100.00%、100.00%及84.62%；对克林霉素、四环素、左氧氟沙星的耐药率较高，分别为48.08%、28.85%及和32.69%；其次为甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、庆大霉素、莫西沙星，耐药率分别为13.46%、15.38%及17.31%。暂未发现对利奈唑胺、替加环素、替考拉宁及对照组万古霉素耐药株(见表2)。

表2 52株MRSA的抗菌药物药敏实验结果

三、MLST分型结果

52株MRSA分属为13个MLST型，其中主要为ST59(21株，40.38%)及ST5(14株，26.92%)；共鉴定出5种SCCmec型，主要为IV型(36株，69.23%)及III型(10株，19.23%)(见表3)。

表3 MLST及SCCmec分型结果

讨 论

金黄色葡萄球菌可采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点序列分型(MLST)、SCCmec等多种技术进行分型鉴定[4]。PFGE为限制性核酸内切酶多态性分型技术，作为细菌分型性检测的“金标准”，可用于研究同种菌株间的同源性、分子流行病学研究等[6]。然而，细菌在进化过程中会随机发生各种点突变、基因片段缺失或插入等遗传变异，造成目的基因酶切位点在空间分布或/和数量上发生改变，进而造成同一菌株其PFGE电泳图谱呈现多样性；并且，PFGE的结果判读有较强的主观性，有作者认为同一电泳图谱的解读可能不尽相同，影响解读结果[7]。MLST分型技术基于7个管家基因，因其核酸序列进化上保守，良好的延续性确保了较高的菌株分辨力。并且，测序结果客观，因此其对菌株的分型更加准确，更广泛被应用[8-9]。

MRSA是临床常见的耐药菌，常引起重症肺炎、导管内感染、皮肤软组织感染、脓毒症或脓毒症休克等严重的感染性疾病，对其耐药性分析及分型鉴定一直是医院感染病研究工作重点。本次提取样本的实验分析显示，我院RICU病房MRSA菌株主要来自呼吸道分泌物，其次为血液、胸腔引流液、皮肤软组织、尿液与腹腔引流液，与文献报道较为相符[10]。

本研究结果表明MRSA具有多重耐药特征，对β-内酰胺类抗菌药物高度耐药，对大环内酯类、四环素类、磺胺类、氨基糖苷类与喹诺酮类等抗菌药物都表现出不同程度的耐药，仅有噁唑烷酮类、糖肽类、甘氨酰四环素类抗生素表现出高度敏感性。对苯唑西林、头孢唑林完全耐药；红霉素耐药率高达84.62%；第三代喹诺酮类药物左氧氟沙星和莫西沙星耐药率分别为32.69%和17.31%；甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、庆大霉素耐药率分别为13.46%及15.38%，耐药率相对较低。治疗MRSA 感染的一线药物可选择万古霉素、利奈唑胺或替加环素等，其中万古霉素是治疗MRSA 感染的首选药物[11]。虽然达托霉素已被证实对MRSA 感染有良好的治疗效果，但在肺部无抗菌活性，故不作为肺部MRSA感染治疗常规抗菌药。其他部位MRSA感染可考虑使用达托霉素，但其存在费用高昂，临床用药经验缺乏等问题[12]。

由于MRSA的耐药性存在区域差异，MRSA感染经验治疗的抗生素选择需根据不同区域MRSA的耐药模式、感染部位、药物可选择性、药物不良反应等因素决定[13]。临床应用主要根据药敏试验结果决定联合用药模式，并重视抗菌药物管理，改善MRSA感染治疗结局并减少耐药性产生。