干扰长链非编码RNA TUG1缓解卵清蛋白诱导的哮喘小鼠肺功能损伤和纤维化以及免疫紊乱

任彦红 张凌云 赵少聪 张广超 孙晓敏

哮喘是一种以中性粒细胞等免疫细胞介导的炎症状态，随病程的延长可产生气道不可逆性缩窄和气道重塑，严重影响患者的健康[1]，长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)在人类生理与病理中发挥重要作用，与多种疾病密切相关[2]。其中，调节lncRNA TUG1能缓解缺血-再灌注诱导的肾小管上皮细胞炎症和凋亡[3]，减轻子宫内膜纤维化和炎症[4]，抑制大鼠脊髓缺血再灌注后的炎症损伤[5]。此外，基于前期lncRNA TUG1通过海绵miR-590-5p/FGF1促进哮喘患者气道平滑肌细胞的增殖和迁移的研究[6]，提示干扰长链非编码RNA TUG1对治疗哮喘有巨大的潜力及重要的意义。因此，本实验探讨干扰长链非编码RNA TUG1对卵清蛋白诱导的哮喘小鼠肺功能损伤、纤维化以及免疫紊乱的影响，以期为哮喘的临床治疗提供数据参考。

资料与方法

一、材料与仪器

1 实验动物 SPF级Wistar小鼠，四周龄，雄性，体质量25～30 g,动物购自北京维通利华实验动物技术有限公司,实验动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0011。

2 药物与试剂 卵清蛋白，美国Sigma-Aldrich公司；PCR试剂盒、SDS-PAGE蛋白凝胶、细胞裂解液、Trizol试剂，北京索莱宝科技有限公司；总蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、羟脯氨酸(HYP)试剂盒、英国Abcam公司；PBS磷酸缓冲液、生理盐水、多聚甲醛，北京万佳首化生物科技有限公司；Masson胶原染色试剂、苏木精-伊红染色试剂、瑞氏-吉姆萨染色，北京雷根生物技术有限公司；α-SMA、FN、TGF-β1相关抗体，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；IFN-γ、IL-4等引物，引物设计参考序列均来源于NCBI及Ensembl数据库，合肥知恩生物技术有限公司；诱导型一氧化氮合酶(iNOS)试剂盒、γ干扰素(IFN-γ)试剂盒、白介素-4(IL-4)试剂盒、白介素-10(IL-10)试剂盒，武汉默沙克生物科技有限公司；AKT等相关抗体，上海碧云天生物技术有限公司。

3 主要仪器 Rt2100c酶标仪，美国BioTeK公司；430c雾化吸入器，上海鱼跃医疗设备有限公司；C100自动细胞计数仪，深圳市瑞沃德生命科技有限公司；KL-B2型石蜡包埋机、S700A石蜡切片机，湖北康龙电子科技有限责任公司；ICX41倒置显微镜，舜宇光学科技有限公司；Microfuge 20低温高速离心机，美国BECKMAN公司；HS1800H-U/W超净工作台，成都市苏净科学器材有限公司；AniRes2005动物肺功能分析系统，北京贝兰博科技公司；SY00992大小鼠体描箱，双玉仪器设备有限公司。

二、方法

1 动物与处理 将小鼠随机分为四组，正常对照组(Control)、模型组(OVA)、阴性对照组(OVA+shRNA-NC)、干扰组(OVA+sh-TUG1)。参考文献建模[7]，除正常组注射及雾化吸入相同体积生理盐水外，各组小鼠分腹腔注射0.2mL 1% OVA致敏液, 1周/次，共3次；致敏完成后进行激发，将小鼠置于密闭容器中，5 mL 5% OVA溶液雾化吸入30 min/d，共7 d，建立哮喘动物模型，其中阴性对照组及干扰组小鼠每次在激发前分别腹腔给予2.5 mg/kg shRNA-NC及sh-TUG1，正常对照组及模型组给予相应体积生理盐水。

2 肺功能指标检测 各组小鼠在麻醉状态下进行气管插管，在体描箱内记录静息状态下呼吸通气量，并检测气道阻力改变、肺容积变换指标。

3 支气管肺泡灌洗液、血清、肺组织的收集 各组小鼠在麻醉状态下，用1 mL注射器将预冷的PBS缓冲液通过气管插管缓慢的灌注至双肺，反复冲洗3次，保证灌洗液回吸收率在90%以上。将收集的支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar fluid，BALF)进行离心(4 ℃、1200 r/mim、10 min)并冻存；眼球取血，离心收集上清液；及时解剖，取肺组织，一部分进行蜡块包埋，用于病理形态学观察，剩余部分冻存，用于后续组织蛋白的提取。

4 HE染色观察肺组织 取出包埋处理的组织，用刀片修蜡，组织切片机切片。经水浴展平、将蜡带贴在载玻片上进行烘干。二甲苯脱蜡后，进行苏木精-伊红染色，封片后在显微镜下观察结果。

5 Masson染色观察肺纤维化 取出包埋处理的组织，进行组织切片，二甲苯脱蜡，高浓度到低浓度酒精脱水，Masson胶原染色试剂染色，二甲苯浸泡5 min，封片后在显微镜下观察结果。

6 WB检测肺纤维化指标水平 剩余肝组织制备成匀浆，提取总蛋白。BCA试剂盒进行总蛋白定量，电泳、转膜、脱脂奶粉封闭，加入一抗，4℃孵育过夜，TBST冲洗，加入二抗，TBST冲洗3次，ECL显影后分析灰度值，实验重复3次。

7 试剂盒检测肺组织中HYP含量 取小鼠肝组织剪碎，加入提取液在110℃烘箱内消化6 h ,离心过滤后调节PH为7左右，将标准品梯度稀释，按照HYP含量检测试剂盒进行操作，混匀后水浴20 min，再静置至室温，取溶液在96孔板中，调节波长560nm，酶标仪检测。

8 哮喘小鼠肺组织炎症评分 炎症评分表评估肺组织的炎症程度，参考Underwood标准[8]。

9 检测BALF液中炎症细胞计数情况 BALF液离心后，用PBS重悬。采用血细胞计数板检测总的炎症细胞，取重悬液滴于防脱载玻片上根据试剂盒说明书采用瑞氏-吉姆萨染色来分类，计算各细胞数量。

10 ELISA检测BALF液中炎症因子含量 分别按照iNOS 、IFN-γ 、IL-4 、IL-10试剂盒说明书操作，用酶标仪进行检测。

11 RT-PCR检测BALF液中炎症因子水平 BALF液离心后，用PBS重悬后，用Trizol法提取总的RNA，并测定浓度，按照PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis kit 逆转录试剂盒的说明进行操作，加入相应引物及样品，每组设置三个复孔。用2-△△Ct法计算iNOS mRNA、IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA、IL-10 mRNA的相对表达水平。

12 WB检测肺组织中AKT/NF-κB通路的相关蛋白表达 采用AKT、p65等相关一抗，根据2.6的操作进行。

三、统计学分析

结 果

一、干扰lncRNA TUG1对OVA小鼠肺功能损伤的影响

与Control组相比，OVA模型组小鼠的肺容积、静息通气量、气道阻力均显著降低(P<0.05，见图1)；与OVA模型组相比，OVA+shRNA-NC组差异无统计学意义，OVA+sh-TUG1组小鼠的肺容积、静息通气量、气道阻力均显著升高(P<0.05，见图1)。结果提示，干扰lncRNA TUG1能缓解OVA小鼠肺功能损伤。

图1 各组对OVA小鼠肺功能损伤的影响与Control组比较，*P<0.05；与OVA组比较，#P<0.05

二、干扰lncRNA TUG1对OVA小鼠肺组织HE染色的影响

Control组小鼠肺组织结构清晰，未见病理形态变化，支气管壁胶原层较薄；OVA模型组肺组织结构明显破坏，肺泡壁结构紊乱，肺泡间隔增厚，肺泡腔缩小，炎性浸润明显；OVA+shRNA-NC组的病理程度与OVA模型组接近；OVA+sh-TUG1组对上述病理状态有一定的缓解，小鼠的肺组织炎性细胞浸润区域较少，肺组织结构完整(见图2)。结果提示：干扰lncRNA TUG1能改善OVA小鼠肺组织的病变程度，缓解OVA小鼠肺部损伤，与3.1结果吻合。

图2 各组对OVA小鼠肺组织HE染色的影响(×100)

三、干扰lncRNA TUG1对OVA小鼠肺纤维化的影响

Control组小鼠肺组织仅有少量胶原，肺泡结构完整，无肺泡内出血；OVA模型组小鼠肺泡内肺泡结构消失，胶原蛋白围绕气管和肺泡大量增殖，导致正常肺泡结构消失或黏连；OVA+shRNA-NC组的纤维化程度与OVA模型组接近；OVA+sh-TUG1组对上述胶原蛋白异常增殖状态有一定的缓解(见图3A)。

与Control组相比，OVA模型组小鼠的α-SMA、FN、TGF-β1蛋白表达显著升高(P<0.05，见图3B-C)；与OVA模型组相比，OVA+shRNA-NC组差异无统计学意义，OVA+sh-TUG1组小鼠的α-SMA、FN、TGF-β1蛋白表达均显著降低，P<0.05。(见图3B-C)。结果提示，干扰lncRNA TUG1能降低OVA小鼠肺纤维化程度。

图3 各组对OVA小鼠肺纤维化的影响(×100)与Control组比较，*P<0.05；与OVA组比较，#P<0.05

四、干扰lncRNA TUG1对OVA小鼠肺组织羟脯氨酸(HYP)含量的影响

HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，其含量反映胶原组织代谢及纤维化程度。与Control组相比，OVA模型组小鼠的HYP含量显著升高，P<0.05(见图4)；与OVA模型组相比，OVA+shRNA-NC组差异无统计学意义，OVA+sh-TUG1组小鼠的HYP含量均显著降低(P<0.05)(见图4)。结果提示，干扰lncRNA TUG1能减少HYP代谢，降低OVA小鼠肺纤维化程度，与3.3结果吻合。

图4 各组对OVA小鼠肺组织HYP含量的影响与Control组比较，*P<0.05；与OVA组比较，#P<0.05

五、干扰lncRNA TUG1对OVA小鼠肺组织炎症评分的影响

与Control组相比，OVA模型组小鼠的肺组织炎症评分显著升高(P<0.05)(见图5)。与OVA模型组相比，OVA+shRNA-NC组差异无统计学意义，OVA+sh-TUG1组小鼠肺组织炎症评分显著降低(P<0.05，见图5)。结果提示，干扰lncRNA TUG1能明显缓解OVA小鼠的炎症损伤。

图5 各组对OVA小鼠肺组织炎症评分的影响与Control组比较，*P<0.05；与OVA组比较，#P<0.05

六、干扰lncRNA TUG1对OVA小鼠BALF液中各项细胞指标计数情况

与Control组相比，OVA模型组小鼠的炎症细胞总数、中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞数目显著增加(P<0.05)(见图6)。与OVA模型组相比，OVA+shRNA-NC组差异无统计学意义，OVA+sh-TUG1组小鼠以上各项炎症细胞数目均显著减少(P<0.05)(见图6)。结果提示，干扰lncRNA TUG1能明显缓解OVA小鼠的炎症损伤，与3.5结果吻合。

图6 各组对OVA小鼠BALF液中各项细胞指标计数的影响与Control组比较，*P<0.05；与OVA组比较，#P<0.05

七、干扰lncRNA TUG1对OVA小鼠BALF液中炎症指标含量的影响

与Control组相比，OVA模型组小鼠的iNOS、IFN-γ、IL-4、IL-10含量均显著升高(P<0.05)(见图7)。与OVA模型组相比，OVA+shRNA-NC组差异无统计学意义，OVA+sh-TUG1组小鼠的促炎因子iNOS 、IFN-γ含量均显著降低(P<0.05)(见图7A)。抗炎因子IL-4、IL-10含量均显著升高(P<0.05)(见图7B)。结果提示，干扰lncRNA TUG1能明显改善OVA小鼠的炎症程度，与3.5、3.6结果吻合。

图7 各组对OVA小鼠BALF液中炎症指标含量的影响与Control组比较，*P<0.05；与OVA组比较，#P<0.05

八、干扰lncRNA TUG1对OVA小鼠BALF液中炎症指标mRNA表达的影响

与Control组相比，OVA模型组小鼠的iNOS mRNA、IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA、IL-10 mRNA表达均显著升高(P<0.05)(见图8)。与OVA模型组相比，OVA+shRNA-NC组差异无统计学意义，OVA+sh-TUG1组小鼠的促炎因子iNOS mRNA、IFN-γ mRNA表达均显著降低(P<0.05)(见图8A)。抗炎因子IL-4 mRNA、IL-10 mRNA表达均显著升高(P<0.05)(见图8B)。结果提示，干扰lncRNA TUG1能明显改善OVA小鼠的炎症程度，与3.5、3.6、3.7结果吻合。

图8 各组对OVA小鼠BALF液中炎症指标mRNA表达的影响与Control组比较，*P<0.05；与OVA组比较，#P<0.05

九、干扰lncRNA TUG1对OVA小鼠肝脏中AKT/NF-κB通路相关蛋白的影响

与Control组相比，OVA模型组小鼠的p-AKT/AKT、p-P65/P65相对蛋白的表达显著升高；与OVA模型组相比，OVA+shRNA-NC组差异无统计学意义，OVA+sh-TUG1组小鼠p-AKT/AKT、p-P65/P65相对蛋白表达均显著降低(P<0.05)(见图9)。结果提示，干扰lncRNA TUG1能降低OVA小鼠肺纤维化程度，其机制可能与调控AKT/NF-κB通路的相关蛋白有关。

图9 各组对OVA小鼠肝脏中AKT/NF-κB通路相关蛋白的影响与Control组比较，*P<0.05；与OVA组比较，#P<0.05

讨 论

近年来研究显示，lncRNA是研究呼吸系统疾病中的热门方向，具有参与基因调控，阻断或促进疾病发展的潜力，其中lncRNA与哮喘的研究密切相关[9]，可作为临床判断、评估预后的生物学指标以及后期治疗的靶点[10]。Fan等[11]发现lncRNA TCF7通过靶向TIMMDC1/Akt参与哮喘气道平滑肌细胞的生长和迁移；Zhang等[12]的研究表明干扰lncRNA-AK149641的会缓解OVA诱发的哮喘小鼠模型中的气道炎症反应，这可能与NF-κB信号通路的调节有关。此外，基于前期lncRNA TUG1对哮喘患者气道平滑肌细胞的增殖和迁移的研究。本实验探讨干扰长链非编码RNA TUG1对卵清蛋白诱导的哮喘小鼠肺功能损伤、纤维化以及免疫紊乱的影响。

肺功能检查是呼吸系统疾病的不可或缺的检查，广泛用于疾病诊断、病情分级、疾病发展、预后评估、治疗方案选择、疗效评估等，具有重要的临床意义[13]。HE染色是观察肺组织细胞成分与病变形态结构的常用方法。Zhang等[14]指出干扰lncRNA BCYRN1增加了OVA大鼠的肺容积、静息通气量，缓解肺组织的病变程度，减轻了哮喘对肺的损害。Hu等[15]发现LncRNA TUG1逆转LPS诱导肺损伤，HE检测显示肺组织的病理程度减轻。本实验显示，OVA+sh-TUG1组小鼠的肺容积、静息通气量、气道阻力均显著升高，小鼠炎性细胞浸润区域较少，肺组织的病变程度减轻，提示干扰lncRNA TUG1能缓解OVA小鼠肺功能损伤，与上述研究一致。

哮喘常见的肺部免疫介导性疾病。具有气道高反应性、嗜酸性粒细胞增多、炎性因子增强、细胞浸润，杯状细胞及黏液增加等特征。长期反复慢性哮喘会导致皮下肺纤维化[16]。大量研究已证明，香草素受体4型瞬时感受器电位通道(transient receptor potential vanilloid 4 channel, TRPV4)的相关蛋白会诱导肌成纤维细胞生成，即α-平滑肌动蛋白(Smooth muscle actin,α-SMA)、纤维粘连蛋白(fibronectin, FN)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)等促进肺纤维化的发生发展[17]。Huang等[18]指出lncRNA FENDRR主要通过下调TGF-β1表达，抑制肺成纤维细胞活化，从而减少肺纤维化，改善肺功能。Zhang等[19]的报道，显示干扰lncRNA NEAT1可增强E-钙粘蛋白的表达，并降低TGF-β1、p-Smad2、α-SMA的表达，通过调节miR-9-5p和TGF-β信号来抑制上皮细胞-间充质转化，从而缓解肺纤维化。HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，目前测定肺脏羟脯氨酸的含量是评价肺纤维化程度的常用方法，是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标[20]。Qu等[21]研究表明肺纤维化程度与HYP含量呈负相关。本实验显示，OVA+sh-TUG1组小鼠的α-SMA、FN、TGF-β1蛋白表达均显著降低、HYP含量显著减少，提示，干扰lncRNA TUG1能降低OVA小鼠肺纤维化程度，与上述研究一致。

统计肺泡灌洗液(BALF)中淋巴细胞(lymphocyte,LYM)、中性粒细胞 (Neutrophils, NEU) 、 嗜酸性粒细胞(Eosinophils, EOS)等免疫细胞数目是检查呼吸系统疾病的常用方法。其中，Wang等[22]指出肺组织中的免疫细胞(NK细胞、单核细胞、中性粒细胞等)可以反映疾病的严重程度并参与肺纤维化的发展。Zhang等[12]的研究表明OVA小鼠的总细胞数和嗜酸性粒细胞数显著增加，而lncRNA AK149641的下调显著降低了炎症细胞的浸润。Nakagome等[23]研究显示体内IL-10基因传递通过抑制肺中TGF-β的生成和激活，减弱博莱霉素诱导的肺纤维化。Liu等[24]指出LncRNA-CASC7通过靶向miR-21抑制PI3K/AKT信号通路，抑制相关炎性因子表达，缓解哮喘的发生。本实验显示，OVA+sh-TUG1组小鼠肺组织炎症评分降低、各项炎症细胞数目减少、促炎因子表达降低、抗炎因子表达升高。结果提示，干扰lncRNA TUG1能明显缓解OVA小鼠的免疫紊乱，与上述研究一致。

哮喘的特征在于气道的炎症反应。山奈酚通过抑制p65、IκB、AKT的磷酸化以及HO-1的表达，调节 AKT/NF-κB信号通路，在哮喘中发挥抗炎作用的分子机制[25]。本实验显示OVA+sh-TUG1组小鼠p-AKT/AKT、p-P65/P65相对蛋白表达均显著降低。与上述研究一致，结果提示，干扰lncRNA TUG1能降低OVA小鼠肺纤维化程度，其机制可能与调控AKT/NF-κB通路有关。

综上，干扰lncRNA TUG1能缓解OVA小鼠肺功能损伤、肺纤维化程度及免疫紊乱，具有靶向治疗哮喘的潜力，其机制可能与调控AKT/NF-κB通路的相关蛋白有关。