牛蛙源弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定和药敏分析

黄志艺，谢丽琴，许嘉龙，刘琦涛，杨培奎

（韩山师范学院 生命科学与食品工程学院，广东 潮州 521041）

牛蛙（Rana catesbeiana）原产于北美洲和墨西哥等地，其肉质鲜美，营养价值较高，且其皮、油和腺体等可作为工业、养殖业和医药业的原料［1-2］.自上世纪60年代引入我国以来，经过多年的推广已成为我国主要水产养殖产业之一，其年产量已超过15 万吨［3］.然而，近年来由于牛蛙养殖密度增大、水质恶化，病害也日益突出.目前已报道的病害主要有寄生虫病、病毒性疾病以及由变形菌（Proteus vulgaris）、链球菌（Streptococcus）、达卡气单胞菌（Aeromonas dhakensis）、金黄杆菌（Chryseobacterium sp.）等引起的细菌性疾病［4-8］.其中，细菌性疾病由于致病菌种类多、致病的病因复杂、发病和致死率高等原因经常给牛蛙养殖业造成重大的经济损失，因此一直以来都是牛蛙养殖中病害防控的重点［9］.

在养殖过程中，水体环境的污染、富营养化等导致水体中致病菌大量繁殖，严重危害水生动物的生存，致使病害频发.因此，养殖环境中致病微生物的防治对于健康养殖、病害防控具有重要意义.为此，本研究运用传统的细菌分离培养方法，从牛蛙养殖场的废水中分离细菌，结合理化特性以及16SrRNA 扩增和系统发育进化分析，鉴定病原.同时，对分离细菌的耐药性以及致病力进行分析，以期为牛蛙养殖过程中环境致病菌的科学防治提供理论依据.

1 材料和方法

1.1 实验材料

牛蛙池塘废水采自广东省汕头市澄海区盐鸿镇牛蛙养殖场；成体幼蛙购自同一地区的种苗繁育基地，开展实验前在实验室暂养5-7 天.陈皮、麻黄、虎杖、广藿香、苦参根、野菊花、蛇床子、丁香、黄柏、艾叶、黄芩、乌梅、五味子等中药材均购自广东省潮州市湘桥区大森林药房.

1.2 主要试剂和仪器

肠杆菌科细菌生化鉴定管、药敏纸片，杭州微生物试剂有限公司；2×Taq PCR StarMix、琼脂糖，北京康润诚业生物科技有限公司；细菌通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’），由华大基因科技有限公司合成.SHP-150 型生化培养箱，上海精宏实验设备有限公司；博日LifeECO 基因扩增仪，杭州博日科技有限公司；Gel DOCTM XR+凝胶成像系统、PowerPac basic 电泳仪，美国Bio-Rad 公司；DYCP-31E 型水平电泳槽，北京六一仪器厂.

1.3 培养基

LB 培养基：蛋白胨1%，酵母膏1%，氯化钠0.5%，pH 值7.2. LB 固体培养基是在LB 液体培养基的基础上加入1.5%～2.0%的琼脂，121 ℃20 min［10］.

1.4 中草药水提取液的制备

分别取陈皮、麻黄、虎杖、广藿香、苦参根、野菊花、蛇床子、丁香、黄柏、艾叶、黄芩、乌梅、五味子等十三种中药30 g，加入500 mL 蒸馏水置于超声波提取器处理提取30 min，随后将各中草药水提取液再加热煮沸1 h，以无菌纱布趁热过滤煎液，并将滤液加热浓缩到50 mL.取1 mL浓缩液测定干物质质量，其余保存于-80 ℃备用.

1.5 病原菌的分离纯化及菌悬液制备

将采集的水样，在无菌条件下利用0.7%无菌生理盐水进行一系列稀释后，取100 μL 稀释液均匀涂布于LB琼脂平板，28 ℃，培养24 h.挑选形态特征相似的优势菌落，通过2-3代的划线分离纯化，获得一株优势的纯培养菌株W6，4 ℃保存待用.将W6菌接种至LB液体培养基，28 ℃，150 rpm/min，培养24 h，随后离心收集菌体并用0.7%的无菌生理盐水重悬菌体制成菌悬液.

1.6 病原菌的形态观察和生理生化鉴定

观察纯化后菌株W6 的单菌落形态特征，挑取单菌落进行革兰氏染色，显微镜观察其形态特征.将W6 接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28 ℃，150 rpm/min，培养24 h，随后收集菌体并用0.7%的无菌生理盐水制成菌悬液后接种于生化反应管中，28 ℃培养24 h 后观察结果，生理生化鉴定采用杭州微生物试剂有限公司的肠杆菌科细菌生化鉴定试剂盒，并按照相应的操作进行.

1.7 病原菌16SrRNA基因扩增及其序列分析

利 用 细 菌 通 用 引 物27F （5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ） 和1492R （5' -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3' ）对菌株S15 基因组DNA 进行16SrRNA 基因序列的扩增.16SrRNA 基因PCR 反应体系（10 μL）：2×Taq MasterMix（Dye）5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板1 μL，ddH2O 2 μL；PCR 反应条件：96 ℃3 min；96 ℃30s ，55 ℃1 min，72 ℃2 min，30 个循环；72 ℃延伸10min.随后，取2 μL的PCR产物利用1%琼脂糖凝胶电泳检测，将单一且符合目的大小的PCR产物送广州华大基因科技有限公司完成测序.

将所获得的16SrRNA 基因序列上传至NCBI 数据库，并利行BLAST 进行序列相似性比对，选取与所测序列同源性高的已知菌株的16SrRNA 基因序列.采用MEGA7.0 软件，Neighbor-Joining 法进行聚类分析和构建系统进化树［5］.

1.8 抗生素敏感性试验

参照KB纸片扩散法［11］，即以涂布法接种0.1 mL1.0×107CFU/mL 的菌悬液于LB培养基平板上，然后将药敏纸片（杭州微生物试剂有限公司）贴于培养基上，28 ℃培养24 h 后，测定其抑菌圈直径（mm），每种药物平行重复三次，确定分离菌株对抗生素的敏感性.

1.9 中草药水提取液对W6菌株抑菌活性分析

参照课题组此前的方法［12］，在LB 培养基平板上涂布接种0.1 mL1.0×10⁷CFU/mL 的菌悬液.随后，放置直径为6 mm 的灭菌滤纸，并用20 μL 的中草药水提取液浸润.将培养皿置于28 ℃培养24 h，随后测定抑菌圈直径.以头孢霉素（20 μL，0.1 mg/mL）为阳性对照，以蒸馏水20 μL为阴性对照，所有的分析进行三次重复.

用二倍稀释法测定中槽药水提取物对W6 菌株的MIC 和MBC.首先，在96 孔板中按照每孔100 μL的量加入LB液体培养基.随后，在每一排的第一孔中加入100 μL中草药水提取液（100 μg/mL），充分混匀后取100 μL 至第二孔，并依次稀释至第11 孔，第12 列孔作为空白对照.每个孔接种加入1 μL 稀释至1.0×103CFU/ml 的菌液，28 ℃培养24 h，观察并记录MIC、MBC，平行重复3 次，每组数值取平均值.

1.10 细菌致病性试验

为了检测分离菌株W6 的致病性，以牛蛙为实验动物进行细菌致病性实验.将W6 接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，28 ℃培养24 h后收集菌体，用0.7%的无菌生理盐水制成浓度为1×109cell/mL的菌悬液.采用腹腔注射的方法进行感染实验，其中实验组每只牛蛙注射100 μL 菌悬液，对照组注射同等剂量的无菌生理盐水.注射之后的牛蛙放入塑料桶中暂养，随后每隔24 h 观察并记录一次牛蛙的死亡情况，实验为期168 h.

2 结果

2.1 病原菌的形态特征

菌株W6在LB培养基上形成的菌落呈圆形、中间隆起、边缘整齐、表面光滑.革兰氏染色的结果表明，该菌株为革兰氏阴性菌株，镜检观察其为两端钝圆的短杆菌（图1）.

图1 革兰氏染色后病原菌的形态特征

2.2 病原菌的生理生化特性

菌株W6 生理生化特性见表1.参考《伯杰氏系统细菌学手册》，菌株W6的生理生化特性与弗氏柠檬酸杆菌的基本一致.对菌株W6 在甲基红、硫化氢、动力琼脂、山梨醇、木糖、葡萄糖等的检测结果均为阳性；在靛基质、侧金盏花醇、尿素、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、苯丙氨酸脱氢酶等的检测结果均为阴性，上述生理生化特性鉴定结果与弗氏柠檬酸杆菌参考菌株的生理生化特性一致.

表1 W6革兰氏阴性杆菌生理生化鉴定结果

2.3 16SrRNA基因序列分析

分离菌株W6 的16SrRNA 基因PCR 扩增后，分别获得大小为1 401 bp 的片段，

与预期结果一致.将测序结果在NCBI 上采用BLAST 进行同源性比对分析，结果显示分离菌株W6 的16SrRNA弗氏柠檬酸杆菌同源性均为99% 以上.采用MEGA7.0软件，通过Neighbor-Joining方法构建系统发育树（图2），结果显示该菌株与弗氏柠檬酸杆菌同一进化分支.根据细菌形态观察、生理生化鉴定结果及16SrRNA基因基因序列分析，可确定分离菌株W6 为弗氏柠檬酸杆菌.

图2 W6菌株16SrRNA基因序列与部分相关菌株的系统发育树

2.4 病原菌的耐药性

采用药敏纸片法测试分离菌株W6对30种抗菌药物的敏感性，结果如表2所示.分离菌株W6 仅对呋喃唑酮和头孢他定2 种抗生素高度敏感；对丁胺卡那、头孢哌酮、哌拉西林、多粘霉素B 等4 种药物中度敏感；对麦迪霉素、青霉素、诺氟沙星、苯唑西林、氧氟沙星、氨苄西林、环丙沙星、庆大霉素、羧苄西林、万古霉素、卡那霉素、新霉素、头孢氨苄、复方新诺明、四环素、头孢唑啉、多西环素、头孢拉定、氯霉素、米诺环素、头孢呋辛、克林霉素、红霉素、头孢曲松等24种抗生素不敏感.

表2 抗生素敏感实验结果（单位：mm）

2.5 中草药对病原菌的抑菌作用

由表3可知，五味子、乌梅、黄芩、艾叶等4种草药水提取液对分离菌株W6 具有一定抑菌作用.进一步分析上述中草药水提取液对分离菌株W6 的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）.具体结果如表4 所述，黄芩水提取液、乌梅水提取液、五味子水提取液、艾叶水提取液对分离菌株W6 的MIC 分 别 是23.0 mg/mL、1.6 mg/mL、2.4 mg/mL 和6.3 mg/mL；MBC 分别是46.0 mg/mL、3.1 mg/mL、4.9 mg/mL和12.5 mg/mL.

表3 中草药水提取液对菌株W6的抑菌活性

表4 中草药水提取液对菌株W6的MIC和MBC

2.6 致病性试验

对牛蛙进行人工感染实验，结果如图3 所示.试验组的牛蛙在24 h 内即出现死亡，并在48 h 内累积死亡率即超过50%，在72 h 内累积死亡率达到60%.而对照组仅在48 h时出现1个个体死亡的情况.这表明该分离菌株具有较强致病性.

图3 牛蛙注射W6菌株的累积死亡率

3 讨论

3.1 弗氏柠檬酸杆菌的鉴定

弗氏柠檬酸杆菌是一种革兰氏阴性短杆菌属肠杆菌科、枸橼酸杆菌属［13-14］.一般而言，不同菌株来源的弗氏柠檬酸杆菌，其理化特性可能存在差异.刘张淮等［15］分离的克氏原螯虾源弗氏柠檬酸杆菌与陈绮梨等［16］分离的加州鲈源弗氏柠檬酸杆菌，苏英等［17］分离的大鲵源致病性弗氏柠檬酸杆菌以及本研究发现的分离菌株W6 其利用尿素的特性存在差异.有研究指出，同种不同来源菌株的生理生化特性差异可能与不同菌株的来源地区、气候、实验室培养条件等差异有关［18］.因此，细菌的鉴定通常需要在生理生化分析的基础上，进一步结合分子鉴定加以确认［19］.

3.2 弗氏柠檬酸杆菌的致病性

弗氏柠檬酸杆菌作为一种水产动物常见病原菌以及人鱼共患的致病菌广泛存在于自然水体中［20-21］.感染水产动物之后，可引起脾脏和肝脏坏死肿大，消化道出现炎症，体表出血或腐烂，肌肉水肿等症状［15］.此前有研究表明弗氏柠檬酸杆菌是牛蛙“红腿症”的致病菌之一［22-24］.同时大量的研究证实，弗氏柠檬酸杆菌可引起克氏原螯虾［25］、罗非鱼［26］、花鳗鲡［27］、团头鲂［28］、大鲵［29］等水产经济动物的病害并造成较大的经济损失.不同来源的弗氏柠檬酸杆菌的致病性通常存在差异.陈绮梨等［16］对鲈源的弗氏柠檬酸杆菌进行人工回归感染实验发现，经1×108CFU/mL 菌悬液浸泡感染，在浸泡16 h 后出现死亡，连续观察7 d 发现其累积死亡率达60%.苏英等［17］对大鲵源弗氏柠檬酸杆菌进行人工感染回归实验发现，对大鲵的半致死浓度（LD50）为3.16×106CFU/mL.本实验的分离菌株在腹腔注射0.1 mL 1×108CFU/mL，在48 h其累积死亡率可达60%，这表明该分离菌株具有较强的致病性和毒力.

3.3 弗氏柠檬酸杆菌的耐药性

弗氏柠檬酸杆菌对抗生素的耐药性因菌株不同、宿主差异以及环境等因素存在差异.本研究的分离菌株对大环内酯类、青霉素类和四环素类抗生素已经产生明显耐药性，这与苏英等［17］、卢君辉等［30］、白杰等［31］的报道类似.而本研究的分离菌株W6 对诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星等喹诺酮类抗生素表现为耐药性，这与陈绮梨等［16］的报道存在差异，但与张冬星等［28］的研究类似，这可能与菌株来源地的养殖环境、用药情况以及宿主的差异有关［32］.因此，对于养殖过程中出现的细菌性病害应快速进行病原分离鉴定和敏感药物筛选，从而为病害科学防治提供依据［16］.

中草药来源广泛、价格低廉、毒性低、不易产生耐药性，在当前限制使用抗生素的形势下，使用中草药提取物替代传统抗生素已逐渐成为解决病原菌耐药性的有效方式之一［12］.本研究发现五味子、乌梅、黄芩、艾叶等中草药水提取液对分离菌株W6具有一定的抑菌效果.在本课题组前期的研究中，五味子对嗜水气单胞菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌都具有较强的抑菌作用［12］.叶伟东等发现乌梅水提取液对加州鲈源的嗜水气单胞菌具有良好的抑菌效果［33］.这可能与五味子含有鞣质，乌梅含有有机酸等抗菌物质有关［34-35］.虽然体外抑菌实验表面五味子、乌梅、黄芩和艾叶对弗氏柠檬酸杆菌具有一定的防治效果，但抗菌机制还需进一步研究.