蛹虫草中谷氨酰胺转氨酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

杨 聪， 郭丽琼， 叶志伟， 邹 苑， 余颖豪， 林俊芳*

（1 华南农业大学食品学院生物工程系 广州510640 2 广东省微生态制剂工程技术研究中心 广州510640）

虫草菌是我国传统医药用真菌， 属于大型药食同源真菌。 蛹虫草【Cordycepsmilitaris （Vuill.）Fr.】，又名迷力菌、虫草花，是麦角菌科（Clavicipitaceae）虫草属（Cordyceps）的模式种[1]，富含虫草素、虫草多糖、甾醇等对人体有益的活性物质及微量元素，具多种抗性，有免疫调节活性[2]。蛹虫草在卫生部2009年底3 号公告中被正式批准为新资源食品，在2014年被纳入新食品原料[3]。

谷氨酰胺转胺酶（又称转谷氨酰胺酶）是一种天然蛋白质交联剂， 能催化蛋白质中谷氨酰胺残基的γ-羟胺基团与伯胺化合物（酰基受体）之间发生酰基转移反应，使蛋白质发生共价交联，通过胺的导入、 交联及脱胺3 种途径对蛋白质进行改性[4]，被誉为“21 世纪超级黏合剂”。 该酶广泛存在于生物界中， 来源于微生物的TGase（Microbial transglutaminase， MTG）属胞外酶，底物特异性低，在无Ca2+存在的条件下仍有催化活性[5]，工业上主要通过微生物发酵制备，原料廉价、周期短，利于大规模工业制备， 用于食品工业改善蛋白质功能性质。 目前MTGase 最主要的微生物来源是链霉菌属，如茂源链霉菌、吸水链霉菌等，然而链霉菌来源的MTGase 在食品工业中应用的安全性有待考证，尚有争议。从大型食用真菌虫草属的蛹虫草CM01 中获取，其来源是食用真菌，食品安全性得到保证。 目前MTGase 的食用真菌来源只有香菇[6]。 近年来，对TGase 研究集中在应用领域的拓展及对TGase 进行基因改造， 用重组表达系统来实现酶的高表达。

巴斯德毕赤酵母，是甲醇营养型酵母，以甲醇为唯一碳源，有良好的基因遗传稳定性，翻译后修饰能力，自身蛋白分泌较少，外源蛋白是其发酵液中主要蛋白，分离纯化简单等[7]。 甲基营养型酵母毕赤酵母（Pichia pastoris）是近20年发展起来的一种异源蛋白表达的首选系统[8]，已具有成熟的高密度培养技术。 近年来用重组表达系统来生产TGase 成为工业化生产的主要方式， 应用最为成功的表达系统有大肠杆菌表达系统[9]、棒杆菌表达系统[10-11]和甲基营养型酵母表达系统[12]。 本文所用毕赤酵母GS115 就是甲基营养型酵母， 毕赤酵母不仅可以做到外源蛋白的高表达、高分泌，而且其工程菌株稳定性高，能进行多种翻译后加工修饰，如糖基化、磷酸化等，是当前最适合用来表达蛋白的表达系统[13]。

本文拟从蛹虫草CM01 中获取TGase 相似蛋白的编码基因片段tgM， 转化入毕赤酵母构建工程菌株，进行异源表达，并对其发酵液做TGase 酶活试验， 以此验证蛹虫草中是否有表达TGase 的能力，为TGase 的工业用菌提供新的食用菌来源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒 蛹虫草菌株CM01、大肠杆菌E.coli DHK、 毕氏酵母GS115、pMD18-T 载体质粒、表达载体pPIC9K 质粒，均为本实验室保存。

1.1.2 试剂 DNA 连接酶、Taq DNA 聚合酶、限制性核酸内切酶EcoRⅠ、NotⅠ、SalⅠ，Takara 公司；核酸Marker、蛋白Marker，Thermo Fisher Scientific 公司；Trizol 试剂盒、质粒提取试剂盒、反转录试剂盒、小片段回收试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，Omega 公司；蛋白胨、酵母浸膏，Oxoid 公司； 引物及DNA 测序由北京擎科生物有限公司完成；N-α-CBZ-Gln-Gly、L-谷氨酸-γ-单羟肟酸，Sigma 公司；其它试剂均为分析纯级。

1.1.3 培养基

1） PDA 固体培养基 （按1 L 剂量配制） 马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g；

2） LB 固体培养基（按1 L 剂量配制） 酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，琼脂15 g；

3） YPD 固体培养基 （按1 L 剂量配制） 酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g；

4） MD 培养基 （按1 L 剂量配制） 葡萄糖20 g，琼脂15 g，YNB 13.4 g，生物素0.04 g；

5） BMGY 液体培养基（按1 L 剂量配制）酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，10×YNB（无氨基酵母氮源） 100 mL，10×甘油100 mL，500×生物素2 mL； 无菌水700 mL；1 mol/L 磷酸盐缓冲液100 mL；

6） BMMY 液体培养基（按1 L 剂量配制）酵母提取物10 g， 蛋白胨20 g，10×YNB 100 mL，500×生物素2 mL；1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 6.0）100 mL，甲醇5 mL，无菌水800 mL。

1.2 方法

1.2.1 蛹虫草CM01 的TGase 目的基因克隆 将蛹虫草CM01 进行液体摇瓶发酵培养菌丝， 收集菌丝用trizol 试剂盒提取RNA， 用反转录试剂盒进行反转录获得cDNA， 根据NCBI 查找得到的TGase 相似蛋白基因序列 （基因库查询号NO.NW_006271971.1）， 设计TGase 基因的扩增引物TGF 和TGR （添加6 个组氨酸标签， 便于后期纯化），以蛹虫草CM01 的基因组DNA 为模板，PCR扩增TGase 基因的目的片段。PCR 条件为94 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s；55 ℃退火30 s；68 ℃延伸2 min；30 个循环；4 ℃保存20 min；将PCR 产物纯化回收， 将纯化后的TGase 基因片段与pMD18-T 载体通过DNA 连接酶连接，在含有100 μg/mL 氨苄青霉素（Amp）的平板培养基中对转入重组载体的大肠杆菌DHK 感受态细胞进行筛选，37 ℃培养12～16 h。 挑取阳性转化子以TGT 和TGB 为引物，进行菌落PCR，扩增产物经凝胶电泳验证， 将可以扩增出目的条带大小的转化子进行测序。

1.2.2 重组质粒的构建 将分泌型表达载体pPIC9K 用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切， 酶切体系：EcoRⅠ1.0 μL，NotⅠ1.0 μL， 质粒pPIC9K 10.0 μL，10×缓冲液 2.0 μL，ddH2O 定容到20 μL，37℃酶切1 h， 酶切产物经由1%琼脂糖凝胶电泳回收后获得线性化质粒载体， 测定浓度。 设计TG-9KF（引入EcoRⅠ酶切位点）和TG-9KR（引入NotⅠ酶切位点）引物，对目的片段进行PCR 扩增，同时引入pPIC9K 载体的同源臂。将带有表达载体同源臂的目的片段与双酶切后的pPIC9K 通过重组试剂盒进行连接，转化入大肠杆菌DHK 感受态细胞， 于含100 μg/mL Amp 平板培养基进行筛选，37 ℃过夜培养。 挑取单菌落送测序， 鉴定连接成功，提取重组表达载体pPIC9K-TG。

1.2.3 酵母的电转化及重组子的筛选 将构建成功的pPIC9K-TG 表达载体用SalⅠ单酶切线性化， 产物纯化回收后获得线性化质粒， 用NanoDrop 测定DNA 浓度。 酶切体系：Sal Ⅰ1.0 μL；10×缓冲液2.0 μL； 线性化质粒17.0 μL；37 ℃酶切过夜； 毕赤酵母感受态的制备和电转化方法参照文献[14]。 将酵母转化子涂布于组氨酸缺乏的MD 平板培养基筛选重组子。 选取成功长出的重组子用GS115 通用引物α-factor primer 和3'AOX1 primer 进行菌落PCR 和凝胶电泳， 判断目的基因是否成功整合到毕赤酵母GS115 的基因组中。

1.2.4 重组酵母的摇瓶表达及TGase 酶活测定将得到的酵母重组子用BMGY 培养基活化，30℃、200 r/min 摇床培养至OD600nm=2～6，（16～18 h），离心取菌体， 将收集到的菌体用BMMY 重悬至OD600nm=1.0，进行诱导表达。 摇瓶发酵培养条件为30 ℃200 r/min、 每24 h 加甲醇至甲醇质量分数为0.5%，诱导表达7 d 后得到重组酵母的发酵液。

表1 引物列表Table 1 List of primer

1.2.5 TGase 蛋白纯化 TGase 的蛋白纯化采用镍柱纯化亲和层析法， 步骤如下： 将体积为2.0 mL 的Ni 树脂装入合适的纯化柱中， 用预冷的平衡缓冲液平衡树脂， 将平衡后的树脂与粗酶液混合， 置于磁力搅拌器上搅拌40～60 min 使二者混合， 环境温度4 ℃； 将树脂与粗酶液的混合液过柱； 将20 mL 预冷的洗涤缓冲溶液加入到柱子清洗杂蛋白； 用5 mL 含500 mmol/L 咪唑的洗脱缓冲溶液洗脱，洗脱液进行SDS-PAGE 分析。

1.2.6 TGase 酶活测定 酶活测定采用Crossowicz 比色法，以N-α-CBZ-Gln-Gly 为底物，以L-谷氨酸-γ-单羟肟酸制作标准曲线，具体步骤参照参考文献[15]。 酶活定义为：37 ℃时TGase 每分钟催化底物生成1.0 μmol L-谷氨酸-单羟胺酸（氧肟酸）为1 个酶活单位。

2 结果与分析

2.1 目的基因的验证

以蛹虫草的基因组cDNA 为模板利用引物TGF 和TGR 通过PCR 扩增获得TGase 基因（tgM），如图1 所示，可见距离1 200 bp 处有一条单一、明亮条带，与tgM 片段1 023 bp 符合，电泳结果显示与预期相符。PCR 产物与pMD18-T 载体连接，转化入大肠杆菌DHK 感受态细胞，获得转化子后提质粒后测序， 测序结果表明tgM 基因与NCBI 公布序列完全吻合。

图1 tgM 目的片段PCR 结果Fig.1 PCR results of tgM target fragment

2.2 重组表达载体pPIC9K-TG 的构建

按1.2.2 节的方法所述， 对表达载体pPIC9K进行双酶切和回收后，得质量浓度为100 ng/μL 的产物。 如图2 所示，在8 000～10 000 bp 之间有一明显条带b 与pPIC9K 的9 276 bp 大小符合。将目的片段与线性化载体连接，转化入大肠后，37 ℃培养过夜后进行菌落PCR，挑单菌落送测序，测序结果表明pPIC9K-TG 重组表达载体（如图3）构建成功。 经Sal Ⅰ单酶切后电泳图如图2 的a 条带所示， 在10 000 bp 附近有一条单一、 明亮条带，与pPIC9K-TG 片段10 311 bp 符合，证明基因和载体在大小上基本正确，可进行下一步酶连。

图2 质粒与pPIC9K-TG 重组质粒酶切检测Fig.2 Enzyme digestion idenfication of plasmid and pPIC9K-TG recombinantplasmid plasmid

图3 重组质粒pPIC9K-TG 的构建策略Fig.3 Construction strategy of recombinant plasmid pPIC9K-TG

2.3 酵母的电转化及重组酵母菌的构建与验证

将pPIC9K-TG 电转化转入毕赤酵母GS115中，涂布于MD 平板以筛选菌落。随机选取筛选平板阳性菌落，用pPIC9K 通用引物α-factor primer和3'AOX1 primer 进行菌落PCR。 菌落PCR 结果如图4 所示， 选取的两个样品均在1 200～2 000 bp 之间有一条明亮条带，与用pPIC9K-TG 通用引物PCR 获得的tgM 片段1 528 bp 相符合， 说明随机选取的两个菌落均为阳性重组菌落。 阴性对照c无明显条带。 说明tgM 基因已成功整合到毕赤酵母GS115 的基因组中。

图4 转化子PCR 鉴定结果Fig.4 Identification of transformants by PCR amplification

2.4 重组菌株的诱导表达及纯化

将得到的重组菌株用BMGY 培养基活化至OD600nm=2～6， 收集菌体用BMMY 重悬进行诱导表达。在保证甲醇终质量分数为0.5%的情况下，诱导表达7 d 取发酵上清液及纯化后洗脱液进行纯化后对其SDS-PAGE 分析，如图5a 所示，2 泳道为重组酵母的发酵液， 在40 ku 附近有一明显条带，对应Marker，可知条带大小为38 ku。 而转入pPIC9K空载体的GS115 发酵上清液的1 泳道则无此条带，说明该条带为酵母表达出的目的蛋白，证明目的基因在毕赤酵母GS115 中成功实现胞外表达。

图5 SDS-PAGE 检测毕赤酵母TGase 表达结果Fig.5 Expression results of TGase in Pichia pastoris detected by SDS-PAGE

取发酵上清液进行酶活测定， 以GS115 的发酵上清液为空白对照，测定内含pPIC9K 空载体的GS115 及重组酵母的发酵上清液的酶活。 酶活测定结果为内含空载体的GS115 的发酵上清液无酶活，重组酵母发酵上清液的酶活为100 U/L，说明该目的基因编码表达的目的蛋白确有酶活， 证明从蛹虫草基因组中克隆的tgM 基因具有表达TGase 的功能。

3 讨论与结论

由SDS-PAGE 分析的结果看，蛋白表达量不高，可能的原因有：1）不同种生物对于密码子的偏好性存在差别， 蛹虫草TGase 编码基因与毕赤酵母常用密码子存在偏好性差异， 若本试验的目的基因在翻译中用到毕赤酵母的稀有密码子， 则可能会影响翻译的顺利进行，使得表达产物减少；2）本试验仅单拷贝表达， 也可能是表达量低的原因之一。针对蛋白表达量低可采取的解决办法：1）确定编码基因后对目的基因进行重新设计， 将目的基因的密码子优化为GS115 偏好的密码子， 可使该基因的蛋白表达量增加。 李洪波[16]对TGase 进行密码子优化，优化后的酶活是优化前的2.8 倍，产量是优化前的3.1 倍。 2）可采用不同信号肽，与分子伴侣共表达等方法对目的基因进行改造，进一步提高TGase 的表达量。 Li 等[17]用食品级枯草芽孢杆菌分泌表达TGase 时，换用SPsacB取代了天然信号肽，使其能分泌到胞外，对前肽进行定点诱变后， 上清液中酶活由1.6 U/mg 上升到7.60 U/mg，且具有良好的Ca2+稳定性和温度稳定性；李鹏飞等[18]将含酶原的TGase 的Pro 序列与成熟MTG进行共表达， 成功直接表达了成熟有活性的茂源链霉菌来源的TGase， 单拷贝菌株的酶活值为0.18 U/mL；3）可通过增加外源基因拷贝数来提高表达量，李鹏飞等[18]对目的基因进行了单拷贝和多拷贝表达后发现， 增加拷贝数可明显提高表达量。

由酶活试验的结果来看，酶活性不高，可能的原因有：1）取发酵上清液进行酶活试验，上清液内的酶浓度不高，导致酶活较低；2）当前发酵条件不是最适发酵条件，针对酶活低可采用的解决办法：1）对发酵上清液进行进一步的分离提纯，提高酶浓度；2）优化发酵条件、进行高密度发酵、筛选合适的酵母菌株等都提高产酶量。 李鹏飞等[18]对多拷贝子进行发酵优化后进行高密度发酵，TGase的产量达到了7.3 U/mL，比摇瓶产量提高了近30倍， 说明对其进行发酵最适条件优化可显著提高其蛋白表达量。

本试验验证了基因和载体序列的正确性，从蛹虫草CM01 中克隆得到tgM 基因片段， 构建了重组载体pPIC9K-TG， 并在毕赤酵母成功实现了异源表达，SDS-PAGE 检测试验确定目的蛋白的大小理论值在38 Ku 左右。 酶活试验证实该蛋白具有TGase 催化活性， 确定tgM 基因即为蛹虫草CM01 中编码TGase 的基因序列。谷氨酰胺转氨酶现已为国际公认的食品安全用酶， 但其来源多为霉菌，本试验获得了大型食用真菌来源的TGase，确保了该酶的在食品行业应用的安全性， 丰富了TGase 的微生物来源。