视网膜新生血管鼠模型的研究进展

徐千惠 综述 陈俊 邵毅 审校

南昌大学第一附属医院眼科，南昌 330006

建立视网膜新生血管(retinal neovascularization，RNV)动物模型有助于研究者更加全面深入了解某些疾病，例如糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)、早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity，ROP)和脉络膜新生血管等的生物学特性，同时也可应用于新型治疗方法的测试和新技术的开发[1]。这些基因工程模型鼠概括了RNV在人类中的许多临床表现，但RNV的发展时间、病情进展、病变的大小和外观在不同模型鼠中各不相同。本文介绍RNV阻塞小鼠模型、RNV氧诱导模型和RNV转基因小鼠模型优缺点以及在临床病理研究上的前景，以期为医务人员和相关领域研究者提供有关基因工程模型鼠相对全面的介绍，评估这些疾病的新治疗方法，为研究人员进一步阐明RNV的生物学特性和病理机制研究提供参考。

1 RNV概述

近年来RNV疾病受到越来越多的关注。RNV的形成起源于视网膜血管，具有双血供特性。RNV通常是由于内界膜延伸到玻璃体，在一些情况下，血管向反方向生长进入视网膜下间隙，许多研究已经表明缺血是RNV形成的主要原因[2]。RNV所致疾病的共同特征是视网膜血管的衰减导致视网膜缺血，DR、ROP、视网膜中央静脉阻塞和视网膜分支静脉阻塞被称为缺血性视网膜病变。

RNV是由多种病因引发的脉络膜新生血管芽穿越Bruch膜并在视网膜色素上皮上、下增生形成的纤维血管组织，常伴有视网膜下的浆液性渗出乃至出血，是导致多种眼底疾病视功能损害的主要原因[3]。研究显示，RNV形成过程中涉及多种信号分子表达水平的改变，如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、组织蛋白酶B、碱性成纤维细胞生长因子、白细胞介素8、肿瘤坏死因子以及单核细胞趋化因子等[4-7]。

RNV形成是缺血、缺氧性视网膜疾病发展到终末阶段的特征性表现，如增生性DR和ROP[8]。DR是糖尿病严重的眼部并发症之一，其血管增生阶段,异常的血液沿视网膜血管进入玻璃体。目前还没有模型能完全概括出糖尿病每个阶段发生的神经和血管变化的病理生理学过程[9]。其常用的模型为大鼠腹腔内注射链脲佐菌素诱导，利用硝基脲衍生物链脲霉素的致糖尿病作用诱导大鼠发生糖尿病从而研究DR的特征[10]。氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy，OIR)模型中常见的用于研究DR的是通过激光或光动力诱导RNV形成并伴有视网膜静脉阻塞。

此外，随着基因工程技术的不断发展，可以利用分子生物学手段在小鼠体细胞或生殖细胞内实现转基因或目的基因的敲入或敲除，如表达Kras并敲除Smad5的小鼠以及Kras突变和/或Trp53突变的小鼠成为胰腺癌研究常用的动物模型[11]。淀粉样前体蛋白转基因小鼠模型可被用于研究阿尔茨海默病的病理机制[12]。由此可见。基因工程小鼠模型可以用于探讨特定基因型与疾病表型的关联，极大地丰富了对宿主基因功能和疾病特征的研究。

2 RNV阻塞模型

通过激光和光动力造成小鼠静脉阻塞已成为RNV的有效模型[13]。小鼠视网膜静脉阻塞引起的微血管改变与临床上视网膜分支静脉阻塞相似，包括静脉扩张、血管迂曲和视网膜血管渗出液。激光和光动力可以诱导视网膜或虹膜内血流减少、视网膜缺血和随后新生血管的形成。根据模型制作时影响视网膜静脉数量的改变，该模型可以是视网膜分支静脉阻塞或中央静脉阻塞模型。

模型制作过程如下：当小鼠麻醉结束后，通过尾静脉注射玫瑰孟加拉染料，或腹腔内注射荧光素钠，并在主要静脉选择激光点。如果激光过弱则不会发生闭塞，而过于强烈则会广泛损害视网膜其他区域或引起静脉出血，因此需要调整适宜的激光参数，实现静脉闭塞。当RNV形成发生在单个视网膜或多个视网膜静脉，并用氩激光凝固或光动力方式阻塞后，小鼠可出现视网膜水肿、出血和视网膜静脉闭塞，然后可发现在视网膜缺血区域前后有新生血管形成。

3 RNV氧诱导模型

OIR小鼠模型已成为研究缺血引起的病理性血管生成类疾病的重要模型[14]。该模型的基本机制为视网膜在早期发育过程中暴露于高氧状态下会导致正常视网膜血管发育的阻滞。当模型动物回到正常体温时，在神经组织有充分营养支持的条件下，模型处于相对缺氧状态同时视网膜缺乏正常的血管系统。而这种不受控制、异常的RNV生成与ROP一致。此类OIR小鼠模型优点在于当暴露在高氧环境下时视网膜周围血管消失[15]，当氧气从室内空气中去除，会导致血管与血管之间的新生血管生长至视网膜中周部无血管区域。尽管ROP后期OIR小鼠模型未发生视网膜脱离，但这种缺血介导病理性新生血管形成的OIR模型对于研究DR也十分有用，同时也已经应用到相关抗血管生成的一般研究。此外，小鼠模型的成本和手术时间与其他动物相比是有利的，并且小鼠的视网膜能够相对顺利地发展成病理性血管闭塞和新生血管的合格模型。

4 RNV转基因小鼠模型

4.1 rho/VEGF转基因小鼠

有研究者观察由视紫红质启动子驱动的VEFG转基因小鼠(rho/VEGF小鼠)视网膜内和视网膜下新生血管的发育，提出VEGF在视网膜光感受器中过度表达，表明新生血管起源于视网膜深毛细血管床，延伸至视网膜下间隙。rho/VEGF转基因模型可能与视网膜血管瘤增生患者的疾病实体更密切相关[8]。

4.2 rho/rtTA-TRE/VEGF或IRBP/rtTA-TRE/VEGF转基因小鼠

使用反向四环素置换激活子(reverse tetracycline replacement activator，rtTA)诱导启动子系统，与视网膜紫质蛋白或视网膜受体结合蛋白(interphotoreceptor retinoid-binding protein，IRBP)启动子耦联来控制VEGF转基因表达在视网膜中开始的时间。在没有多西环素的情况下，成年转基因小鼠的VEGF表达很少。在小鼠体内添加多西环素后，VEGF表达明显增多，表达范围更广，并显示与更广泛的新生血管形成有关。

4.3 VEGF165高表达小鼠模型

VEGF165(hVEGF)过度表达转基因小鼠模型可表现为轻度到重度RNV形成。这些转基因小鼠模型通过显微注射含有hVEGF基因的DNA结构，随后hVEGF基因被截断的小鼠视网膜紫质启动子驱动。低hVEGF的转基因系表现出轻度改变，如荧光素渗漏、小动脉瘤和静脉曲张；高hVEGF的转基因系表现出严重表型和广泛的新生血管形成、出血以及视网膜脱离[16]。

4.4 Nrl-/-Grk1-/-双基因敲除小鼠

Nrl-/-Grk1-/-双基因敲除小鼠是从G蛋白耦联受体信息传导通路着手研究，G蛋白耦联受体激酶(G protein-coupled receptor kinase 1，Grk1)参与视锥细胞的失活和正常复苏，神经视网膜亮氨酸拉链基因敲除的小鼠(Nrl-/-)视网膜在生物化学中被称为“全视锥细胞型”。研究显示缺乏Grk1将导致与年龄和光线相关的锥体细胞营养不良。在1月龄小鼠的视网膜全层可观察到新生血管形成，而这些均为炎症通路介导[17]。

5 小结与展望

视网膜周围新生血管的2种类型是脉络膜新生血管以及RNV，RNV起源于视网膜循环，延伸至玻璃体后、玻璃体面或是进入玻璃体，由于血管生成细胞因子扩散到玻璃体，RNV通常会以一种更为随意、迅速的方式增长。RNV是由视网膜大面积毛细血管闭塞、慢性缺血引起，与VEGF的生成和释放有关。新生血管可起自视盘表面及视网膜小静脉，沿视网膜表面生长，在有玻璃体粘连的部位可长入玻璃体内，并含有数量不等的纤维组织。在小鼠模型中，诱导缺血的方法有缺氧、激光、炎症和辐射。RNV小鼠模型可以通过激光光凝或光动力疗法阻断视网膜静脉，诱导RNV和视网膜静脉阻塞。其他小鼠模型包括过表达VEGF转基因小鼠模型以及炎症相关模型。本文介绍了经尾静脉注射玫瑰孟加拉染料或腹腔内注射荧光素钠，通过激光实现静脉闭塞从而在缺血区域形成新生血管的RNV阻塞小鼠模型；通过制造高氧状态使小鼠正常视网膜血管发育阻滞，从而诱导RNV形成的氧诱导RNV小鼠模型；还介绍了一系列基因工程小鼠模型，包括VEGF转基因表达促进新生血管形成的诱导RNV小鼠模型、VEGF165高表达诱导RNV小鼠模型以及Nrl-/-Grk1-/-双基因敲除影响视锥细胞发育的诱导RNV小鼠模型。因此在RNV主要致病因素和治疗方式的研究过程中发现小鼠模型有良好的特征，更易于量化和重现，因此对小鼠模型研究更为普遍。

成功的RNV模型关键在于以不同方式诱导视网膜发生缺血等病理表现，缺血在RNV的发育中起着重要作用。RNV小鼠模型建成的要点是在于寻找各种不同的方式使视网膜缺血，减少血流量，进而通过病理生理机制产生RNV。通过研究模型小鼠的视网膜更有利于详细研究病理血管的生长情况。由于视网膜血管系统在出生后发育，血管的形成和退化都可以在严格控制的环境下进行研究。大量使用小鼠视网膜的研究强调了使用出生后小鼠视网膜的各种活体模型的重要性，以及对我们理解一些威胁视力的疾病背后的血管生成病理机制有重要贡献。RNV小鼠模型对生物机制、转基因和基因敲除模型的研究也有一定作用，对于药物开发研究人员来说，RNV的动物模型提供了药物实验的基础。

不同RNV小鼠模型的形成机制不同，诱导得到的小鼠模型也展现不同的RNV病理形态和产生机制。在未来的研究中，研究者在选取动物模型前应当充分了解RNV形成的机制，根据测试的假设，以及可用资金和实验方向来选择最合适的小鼠模型。使用不同类型模型鼠有助于我们了解视网膜血管生成性病变的一些最明显特征以及后续临床应用治疗的研究。

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