臭氧熏蒸对玉米胚中真菌毒素的降解消除作用

刘玉兰，郑婷婷，马宇翔，王戬东，王月华

（1.河南工业大学粮油食品学院，河南 郑州 450001；2.河北玉星食品有限公司，河北 邢台 055550；3.山东三星玉米产业科技有限公司，山东 滨州 256209）

玉米胚是玉米深加工的副产物，含有丰富的油脂、蛋白、膳食纤维及其他营养成分，是生产食用玉米油和饲用玉米粕的原料[1-2]，但玉米胚较玉米更易感染黄曲霉毒素B1（aflatoxins B1，AFB1）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）和呕吐毒素（deoxynivalenol，DON）等真菌毒素[3-5]，对玉米胚及其制品的食用安全和饲用安全造成威胁[6-7]。近年来，玉米胚和食用玉米油的产量逐年提高，食用玉米油产量超过120万 t[8]。为确保并提升食用玉米油的品质安全，研究人员已对玉米油精炼过程真菌毒素脱除技术进行了研究并取得了一定的成果[9-11]。但目前对玉米胚和玉米粕中真菌毒素控制和脱除技术的研究报道很少，因为对固体物料中真菌毒素的脱除要远比玉米油更加困难。若能对玉米胚中真菌毒素进行消除脱毒，就可以同时兼顾玉米油和玉米粕安全品质的提升，从源头上对真菌毒素进行有效控制，并避免玉米油精炼过程为脱除真菌毒素而采取过度精炼所造成的油脂精炼损耗和营养成分损失。本课题组前期对挤压膨化、微波处理、湿热蒸胚、淡碱蒸胚、臭氧水调质、臭氧熏蒸等方法消除玉米胚中真菌毒素效果进行了比较[12]，得出淡碱蒸胚法[13]和臭氧熏蒸法更具优势。臭氧是氧气在高压放电下产生的同素异形体，具有极强氧化性和杀菌性能[14]。1997年美国食品药品监督管理局就认证了臭氧应用于食品加工中的通用安全性[15]。臭氧熏蒸应用于粮食和油料中真菌毒素的降解也有不少报道[16-18]。但臭氧熏蒸对玉米胚中真菌毒素消除的研究却鲜有报道。本实验依据臭氧的强氧化性可破坏多种真菌毒素分子结构的机理[19]，在前期研究的基础上，对臭氧熏蒸脱除玉米胚中真菌毒素的条件优化和脱毒效果进行较为深入的研究，以期能为玉米胚中真菌毒素脱除技术的发展提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米胚样品取自河北玉星食品有限公司和山东三星玉米产业科技有限公司。

DON标准品（纯度≥99%）、AFB标准品（纯度≥99%）、ZEN标准品（纯度≥99%） 美国Sigma-Aldrich公司；DON免疫亲和柱、ZEN免疫亲和柱、AFB1免疫亲和柱 月旭科技（上海）股份有限公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯） 美国VBS公司；超纯水由实验室通过Molecular超纯水机制得。

1.2 仪器与设备

2695高效液相色谱仪、2475荧光检测器、2489紫外检测器 美国Waters科技有限公司；COM-AD-01臭氧发生仪 鞍山安思罗斯环保有限公司；JSA9紫外臭氧检测仪 深圳市吉顺安科技有限公司；MTN-2800W氮吹浓缩仪 天津艾特赛恩斯仪器公司；FM200均质机上海弗鲁克流体机械制造有限公司；FW400A高速万能粉碎机 北京中兴伟业仪器有限公司；LD5-10台式低速离心机 北京京立离心机有限公司；RE-200A旋转蒸发器郑州亚荣仪器有限公司；Vortex QL-902涡旋仪 海门市其林贝尔仪器制造公司；WSL-2比较测色仪 上海精密科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 臭氧对玉米胚熏蒸处理

打开紫外臭氧检测仪并预热30 min，打开臭氧发生仪，待发生仪稳定后打开氧气罐阀门，通入高纯氧气。调节氧气罐阀门、电压控制器、臭氧流量计等，控制生成臭氧的质量浓度稳定至150 mg/L左右（根据前期实验，随臭氧质量浓度升高真菌毒素降解效果呈升高趋势，降解所需时间也会缩短，对原料品质影响也更小，因此将实验室臭氧发生器调试至能稳定工作的最高生成质量浓度）。将30 g玉米胚样品（水分质量分数为3.98%）放入250 mL玻璃瓶，以蒸馏水调节玉米胚水分质量分数分别至5%、10%、15%、20%、25%、30%左右（通过105 ℃恒质量法确定调节后的样品水分质量分数）。将臭氧气体从瓶底管道通入玻璃瓶并穿过料层对玉米胚进行熏蒸处理，之后多余的臭氧从瓶顶管道放出，熏蒸处理时间分别控制为20、30、40、50、60、80 min。将处理后的样品在60 ℃烘箱中通风干燥1 h，取出后检测样品中AFB1、ZEN、DON含量，并计算3 种真菌毒素的消除率。

1.3.2 玉米胚中真菌毒素含量测定

AFB1含量测定参照GB 5009.22—2016《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》。样品前处理方法参照GB 5009.22—2016中高效液相色谱-柱后衍生法。

色谱条件：色谱柱：C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（45∶55，V/V）；流速：0.8 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：20 μL；激发波长：360 nm；发射波长：440 nm。使用光化学衍生器进行衍生化。

ZEN含量测定参照GB 5009.209—2016《食品安全国家标准 食品中玉米赤霉烯酮的测定》。样品前处理方法参照GB 5009.209—2016中的液相色谱法。

色谱条件：色谱柱：C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（55∶45，V/V）；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；检测波长：278 nm。

DON含量测定参照GB 5009.111—2016《食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》。样品前处理方法参照GB 5009.111—2016中的免疫亲和层析净化高效液相色谱法。

色谱条件：色谱柱：C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（16∶84，V/V）；流速：0.8 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：50 μL；检测波长：218 nm。

1.3.3 真菌毒素消除率计算

玉米胚中真菌毒素的消除率按下式计算。

式中：B为臭氧熏蒸对玉米胚中真菌毒素的消除率/%；X为臭氧熏蒸处理后物料中真菌毒素含量/（μg/kg）；Z为未经臭氧熏蒸前物料中真菌毒素含量/（μg/kg）。

1.3.4 玉米胚中毛油的提取

将玉米胚用高速万能粉碎机粉碎，加入正己烷，于40 ℃水浴加热并搅拌，萃取油脂8 h，之后通过抽滤进行固液分离，取液体（油脂与正己烷溶剂组成的混合油）于45 ℃下旋蒸脱除其中的正己烷溶剂，再在90 ℃下脱除其中残留溶剂，即得到玉米胚毛油。

1.3.5 玉米胚及玉米油指标测定

玉米胚水分质量分数测定参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》（105 ℃恒质量法）；玉米胚毛油酸价测定参照GB 5009.229—2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》；玉米胚毛油过氧化值测定参照GB 5009.227—2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》；色泽测定参照GB/T 22460—2008《动植物油脂 罗维朋色泽的测定》。

1.4 数据处理与分析

每个指标重复测定3 次，测定的数据通过Origin 9.0软件处理及作图，并用SPSS软件中的单因素方差分析进行数据统计分析，利用Duncan多重比较分析样品间差异显著性，以P＜0.05表示有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 臭氧熏蒸条件对玉米胚中AFB1消除效果的影响

将玉米胚水分质量分数分别调节至5%、10%、15%、20%、25%、30%，调节臭氧发生器至臭氧质量浓度检测器示数稳定至150 mg/L，将臭氧通入反应装置与玉米胚反应1 h，玉米胚水分质量分数对AFB1消除效果的影响见图1。

图1 玉米胚水分质量分数对臭氧熏蒸消除玉米胚中AFB1效果的影响Fig.1 Effect of sample moisture content on the removal of AFB1 in corn germ by ozone fumigation

由图1可见，玉米胚水分质量分数对AFB1的消除效果影响显著，随样品水分质量分数的增加，玉米胚中AFB1含量减少，AFB1消除率提高。水分质量分数15%时，AFB1的消除率为66.61%，水分质量分数为25%时，AFB1的消除率达到最高（73.10%），此时AFB1含量由初始的77.29 μg/kg降低至20.69 μg/kg。当样品水分质量分数高于25%时，消除率不再增加，这可能是因为臭氧在水中极易形成·OH和·OOH等具有很强氧化性的含氧自由基，适当增加玉米胚水分质量分数可提高含氧自由基数量，有利于AFB1的降解[20-21]；但当水分质量分数过高时，发现玉米胚在处理过程中易结团粘壁，影响玉米胚与臭氧的均匀接触反应，从而不利于AFB1的降解，这与文献[22]结果相似。因此可选择玉米胚水分质量分数25%作为优化条件。

将玉米胚水分质量分数调节至25%，调节臭氧质量浓度稳定至150 mg/L，将臭氧通入反应装置与玉米胚分别反应20、30、40、50、60、80 min，反应时间对AFB1消除效果的影响见图2。

图2 臭氧熏蒸时间对玉米胚中AFB1消除效果的影响Fig.2 Effect of ozone fumigation time on the removal of AFB1 in corn germ

由图2可见，玉米胚中AFB1消除率随熏蒸时间的延长而提高。60 min时的消除率为69.29%，AFB1含量降至23.64 μg/kg，时间延长至80 min时消除率达到最高（72.27%），AFB1含量降至21.36 μg/kg，但与60 min时的AFB1含量差异并不显著（P＞0.05），表明60 min时臭氧熏蒸对AFB1的氧化降解反应基本达到了平衡。

2.2 臭氧熏蒸条件对玉米胚中ZEN消除效果的影响

维持臭氧熏蒸条件同2.1节，玉米胚水分质量分数对ZEN消除效果的影响见图3。玉米胚水分质量分数对ZEN消除效果有显著影响，水分质量分数为10%时，ZEN消除率为70.07%，此时玉米胚ZEN含量由初始的354.44 μg/kg减少至106.09 μg/kg，水分质量分数超过10%之后，随水分质量分数升高，ZEN含量变化不显著（P＞0.05），在水分质量分数15%时ZEN的消除率最低，为69.44%。综合考虑可选择玉米胚水分质量分数10%作为消除ZEN的优化条件。

图3 玉米胚水分质量分数对臭氧熏蒸消除玉米胚中ZEN效果的影响Fig.3 Effect of sample moisture content on the removal of ZEN in corn germ by ozone fumigation

将玉米胚水分质量分数调节至10%，臭氧质量浓度调节至150 mg/L，分别对玉米胚进行20、30、40、50、60、80 min臭氧熏蒸处理，臭氧熏蒸时间对ZEN消除效果的影响见图4。

图4 臭氧熏蒸时间对玉米胚中ZEN消除效果的影响Fig.4 Effect of ozone fumigation time on the removal of ZEN in corn germ

从图4可以看出，在20～50 min内玉米胚中ZEN含量随熏蒸时间延长而显著降低（P＜0.05），在50 min时消除率可达68.88%，此时ZEN含量由初始的354.44 μg/kg减少至110.31 μg/kg，此后再延长熏蒸时间消除率不再明显变化。王轶凡[23]通过超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱对ZEN及其臭氧降解产物进行的检测分析结果证明，臭氧降解ZEN的过程主要遵循臭氧与烯烃双键加成的Criegee反应机制，同时细胞毒性实验结果表明降解产物毒性降低且无突变性。

2.3 臭氧熏蒸条件对玉米胚中DON消除效果的影响

维持臭氧熏蒸条件同2.1节，玉米胚水分质量分数对DON消除效果的影响见图5。玉米胚水分质量分数对臭氧熏蒸消除玉米胚中DON含量有显著影响。低水分质量分数（5%）时玉米胚中DON消除率较低，当水分质量分数提高至10%时消除率明显提高，达到78.07%；水分质量分数提高至15%时，DON消除率达到90.96%，消除效果最好，此时DON含量由初始的6.68 mg/kg降低至0.60 mg/kg，显著低于GB 2761—2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》规定限量。随水分质量分数继续增加，DON消除率呈总体降低趋势，这可能是因为过高的水分含量使玉米胚结团，影响了臭氧与样品的充分接触。

图5 玉米胚水分质量分数对臭氧熏蒸消除玉米胚中DON效果的影响Fig.5 Effect of sample moisture content on the removal of DON in corn germ by ozone fumigation

将玉米胚水分质量分数调节至15%，调节臭氧质量浓度为150 mg/L，臭氧熏蒸时间分别为20、30、40、50、60、80 min，臭氧熏蒸时间对DON消除效果的影响见图6。

图6 臭氧熏蒸时间对玉米胚中DON消除效果的影响Fig.6 Effect of ozone fumigation time on the removal of DON in corn germ

从图6可以看出，在60 min内，臭氧熏蒸玉米胚中DON的含量随时间延长而显著降低（P＜0.05），60 min时的消除率为82.86%，此时DON含量由初始的6.68 mg/kg降低至1.15 mg/kg，超过60 min后DON含量降低不显著（P＞0.05）。Ren Dongliang等[24]利用液相色谱-四极杆-飞行时间质谱进行检测分析，确定了DON的4 种臭氧分解产物，推测出臭氧破坏了DON的C9—C10处的双键、12,13-环氧环以及C3或C7处的羟基，作用方式符合Criegee机制。王莉等[25]基于DON结构和毒性之间的关系，推断出臭氧分解产物的毒性显着降低。邵慧丽[26]用臭氧处理后的DON污染小麦饲喂小鼠，发现臭氧熏蒸可显著降低小麦中DON的毒性。

2.4 臭氧熏蒸条件对玉米胚毛油品质的影响

鉴于玉米胚臭氧熏蒸过程可能会对其中油脂品质造成不良影响，因此对经不同水分质量分数、不同时间熏蒸处理后的玉米胚提取油脂，并对玉米胚毛油的酸价、过氧化值、色泽进行测定，结果如图7和表1所示。图7A为玉米胚水分质量分数对臭氧熏蒸（1 h）玉米胚毛油酸价和过氧化值的影响，图7B为臭氧熏蒸时间对玉米胚（水分质量分数20%）毛油酸价和过氧化值的影响。

表1 臭氧熏蒸处理对玉米胚毛油色泽的影响Table 1 Effect of ozone fumigation on the color of crude corn oil

图7 臭氧熏蒸对玉米胚毛油酸价和过氧化值的影响Fig.7 Effect of ozone fumigation on the acid value and peroxide value of crude corn oil

由图7A可看出，随玉米胚水分质量分数的增加，臭氧熏蒸玉米胚中油脂的酸价显著升高（P＜0.05），在水分质量分数为30%时达到最高，由初始的6.57 mg/g升高至8.33 mg/g；过氧化值在水分质量分数高于15%后显著增加（P＜0.05），水分质量分数为30%时，过氧化值由初始的6.40 mmol/kg升高至7.32 mmol/kg。刁恩杰[27]发现用湿润的臭氧熏蒸后花生的酸价显著高于直接臭氧熏蒸，因为臭氧与水首先发生反应产生的·OH比臭氧气体具有更强的氧化能力。因此，玉米胚水分含量的增加可能促进了·OH的生成，从而增加了臭氧的氧化性。

随着臭氧熏蒸时间的延长，玉米胚中油脂的酸价和过氧化值持续升高，但总体升幅不大。在80 min时酸价由初始的6.57 mg/g升高至8.06 mg/g；过氧化值在熏蒸时后不超过40 min时无显著变化（P＞0.05），超过40 min后显著增加（P＜0.05），至80 min时过氧化值由初始的6.40 mmol/kg升高至7.32 mmol/kg。

综合考虑臭氧熏蒸对3 种真菌毒素都能有较高的消除率，将玉米胚臭氧熏蒸的优化条件确定为水分质量分数15%、熏蒸时间60 min，经此条件处理后，玉米胚中油脂的酸价升至7.88 mg/g，过氧化值升至6.94 mmol/kg，均未超出GB/T 2716—2018《食品安全国家标准 植物油》中对玉米毛油的品质要求（酸价不超过10 mg/g；过氧化值不超过0.25 g/100 g（9.85 mmol/kg））。因此，臭氧熏蒸处理对玉米毛油品质的影响在可接受范围内。

从表1可以看出，当玉米胚水分质量分数低于20%时，随样品水分质量分数的增加，其对应毛油的红值呈降低趋势。臭氧气体具有漂白和脱色的能力，能降解食品中的类胡萝卜素和花色苷[28]。玉米中含有丰富的叶黄素和玉米黄素（类胡萝卜素类的天然色素），可能在臭氧处理的过程中被降解，使玉米胚色泽变浅。当玉米胚水分质量分数高于20%时，随水分质量分数增加，红值呈上升趋势。邓捷等[29]观察到臭氧处理后的玉米油颜色由淡黄色转变为红褐色。臭氧熏蒸处理玉米胚的过程中，也有可能生成有色的玉米油臭氧氧化产物，从而使毛油的色泽加深。在玉米胚水分质量分数为15%条件下，随臭氧熏蒸时间的延长，玉米胚毛油的红值呈持续降低趋势，熏蒸时间80 min时毛油的红值由处理前的7.9下降至6.0，这与山长坡[30]研究的湿润臭氧处理后花生色泽变化趋势一致。

3 结 论

采用不同的玉米胚水分质量分数及不同熏蒸时间对玉米胚中3 种真菌毒素进行臭氧熏蒸消除，对比分析不同熏蒸条件对玉米胚中真菌毒素消除效果的影响，结果发现，适当提高玉米胚水分质量分数可显著提高臭氧对3 种真菌毒素的消除效果，但当水分质量分数高于20%时，再随水分质量分数增加消除率增长不明显。3 种真菌毒素的消除率与处理时间呈正相关，熏蒸时间达60 min时，3 种真菌毒素均可获得较好的消除效果，继续延长处理时间，反应趋于平衡。基于尽量降低玉米胚水分含量和缩短臭氧处理时间以降低营养成分损失考虑，综合3 种真菌毒素的消除效果，臭氧熏蒸消除3 种真菌毒素的优化工艺条件为臭氧质量浓度150 mg/L、样品水分质量分数15%、臭氧熏蒸时间60 min，此时对3 种真菌毒素（AFB1、ZEN、DON）均有较好的降解消除效果，消除率可分别达66.61%、69.44%、90.96%。随玉米胚水分质量分数升高和臭氧熏蒸时间延长，玉米胚毛油的色泽呈降低趋势，酸价和过氧化值呈升高趋势，但均未超出GB/T 2716—2018中对玉米毛油的品质限量要求。