磺胺类抗生素在畜禽粪便-土壤-植物-水系统中迁移转化研究

余伟达，丘锦荣，王秀娟，夏 迪，蔡倩怡，曾经文，周建利

（1.长江大学农学院，湖北 荆州 434025；2.生态环境部华南环境科学研究所，广东 广州 510653）

【研究意义】在畜禽养殖业中，磺胺类抗生素被广泛用于治疗和预防感染性疾病，促进动物生长以及提高饲料利用率［1-3］。在过去的40 多年中，美国用作生长促进剂的抗生素用量增长了80 多倍［4-5］，是世界上抗生素生产量和使用量最多的国家。研究表明，2013 年我国抗生素的年生产量达16.2 万t 以上，其中52%的抗生素用于畜牧业，相当于美国2012 年畜牧业抗生素使用量的5.77 倍、英国2013 年畜牧业抗生素使用量的200倍［6-10］。而动物肠胃对抗生素的生物利用率有限，约60%～90%的抗生素会以药物原形或代谢物的形态通过排泄物排入环境中［5，11］，造成环境风险。由于抗生素大多较为稳定，部分抗生素固定相稳定存在150 d 以上，部分抗生素随着畜禽粪便进入土壤，在土壤中可持续5～9 个月［12-13］。例如，在农业生态系统的各种介质（包括土壤、水、作物等）中都已检测到高浓度的磺胺类抗生素残留［14-15］。当畜禽粪便直接用于农业施肥时，抗生素有可能在土壤中积累，并被作物吸收。之前的研究也表明，抗生素有可能在不同的植物中积累，并通过食物链转移给人类，对公共健康构成潜在风险［7-8］。因此急需开展畜禽粪便中磺胺类抗生素在农业系统中迁移转化研究。

【前人研究进展】抗生素进入土壤-植物系统后，易发生光降解、微生物降解、地表径流运移、淋溶、植物吸收、吸附或土壤固存［16-17］。Hamscher等［18］研究表明，在用猪粪改良的田地中，0～10、10～20、20～30 cm 深度土壤中四环素浓度分别可达到86、199、172 mg/kg；Stoob 等［19］研究发现，在肥料改良土壤中种植的玉米、莴苣和马铃薯，3 种作物均吸收了磺胺二甲嘧啶，其在植物组织中的浓度范围为0.1～1.2 mg/kg，累积量约为施入有机肥量的0.1%。Kumar 等［20］试验发现，氯霉素会在玉米、青葱和卷心菜等作物中累积，且随着粪便中氯霉素含量的增加而增加。

【本研究切入点】目前对畜禽养殖废物中抗生素的研究主要着重于环境各种介质中的监测和分析，很少学者对抗生素在环境介质中的迁移转化和植物累积方面开展长期的跟踪研究。【拟解决的关键问题】本研究以磺胺类抗生素为对象，研究其在土壤、植物、土壤渗滤液等各种介质中的吸附迁移特性以及玉米对其吸收累积能力，以期为畜禽养殖废物在农业上的合理利用提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

磺胺嘧啶（SD）、磺胺吡啶（SP）、磺胺二甲嘧啶（SM2）、磺胺间甲氧嘧啶（SMM）、磺胺氯哒嗪（SMP）、磺胺多辛（SDM）、磺胺喹啉（SQ）、磺胺二甲氧基嘧啶（SMD）等药品购自Sigma 公司，质量分数均为98%以上，分析过程所用试剂均为分析纯和色谱纯级别。供试玉米种子云石5 号由云南省农科院育种中心提供。供试猪粪来自广州市良种猪场，经脱水处理，含水率50.4%。供试鸡粪来自清远市某大型养鸡场，经晾晒处理，含水率21.5%。供试复合肥（15-15-15）来自广州某肥料厂。供试土壤为广州市郊的水稻土和林地土，水稻土理化性质为：有机质含量9.85 g/kg，总氮、总磷、总钾含量分别为0.57、0.76、0.58 g/kg，阳离子交换量为11.62 cmol（+）/kg，交换性酸为0.63 cmol（+）/kg，pH（水∶土=2.5∶1）为5.46；林地土理化性质为：有机质含量0.29 g/kg，总氮、总磷、总钾含量分别为0.74、0.28、0.34 g/kg，阳离子交换量为19.24 cmol（+）/kg，交换性酸为2.23 cmol（+）/kg，pH（水∶土=2.5 ∶1）为6.59。

1.2 试验方法

室外种植试验于2018 年4-8 月在华南农业大学农业生态与农村环境重点实验室试验农场（113°36′61＂E，23°16′90＂N）进行，试验用地约48 m2，地形平坦。试验采用非常规的盆栽试验。试验地建有长1.0 m、宽1.0 m、深1.0 m微区试验池，池四周用水泥进行防渗处理，池底部设计有渗漏装置，底部有孔，连接有胶管，用于漏水。根据试验基地土壤剖面，试验池从下往上依次填碎石20 cm、林地土50 cm、水稻土30 cm，灌水使其自然沉紧。供试土壤经检测均不含磺胺类抗生素，经过筛去除石块、草根、树根等，混合均匀后分别装填于试验池内。

试验过程最低气温19.4 ℃，最高气温35.4 ℃，平均气温27.8 ℃，总降雨量1 444.0 mm，日平均降雨量17.8 mm。试验期间温度适宜，适合玉米生长，降雨较频繁，但未对玉米的生长造成危害。

试验设不施肥（CK）、施用复合肥、施用鸡粪、施用猪粪4 个处理，每个处理4 次重复。试验前期，对试验场地耕层土壤0～20 cm 进行翻耕并除草，并且按照各处理设置施用不同肥料，将畜禽粪便和复合肥洒于土壤表层，人工翻土使之与耕作层土壤混合均匀。为了不引起土壤pH 升高、土壤碱化等影响，复合肥、鲜鸡粪（含水率约75%）和鲜猪粪（含水率约80%）施用量分别控制在0.13、3.01、5.99 kg/m2，施肥后自然状态下放置24 h 后播种。待苗期为三叶时进行间苗，每个试验池保留6 株。试验期间用地下井水浇灌，大约每隔3 d浇水1 次（因降雨量而定），并人工除草与防治虫害，不喷洒农药，试验过程记录玉米生长情况、温度与降雨量。

试验初期（0 d）采集畜禽粪便、土壤样品（耕作层0～20 cm、深层20～80 cm），玉米生长中期（40 d）与末期（80 d）分别采集渗滤液与土样（耕作层和深层），渗滤液置于棕色样品瓶中于阴凉处待测。所有土壤样品经冷冻干燥碾磨过0.150 mm 筛后，放入棕色样品瓶后置于阴凉处待测。于玉米各生长期测量株高和茎粗，收获期（80 d）采集全株样，依次用自来水、蒸馏水清洗，滤纸吸干水分。全株分成茎叶与果实，将茎叶切成碎末冷冻干燥称重后用棕色样品瓶保存待测，籽粒冷冻干燥后称其百粒重，碾磨过筛后放入棕色样品瓶，置于阴凉处待测。

1.3 样品分析

1.3.1 样品处理（1）样品预处理：畜禽粪便、土壤和植物样品用分析天平分别称取2～3 g（记录具体值）置于50 mL 玻璃离心管中，加入1 μg/mL磺胺类抗生素内标5 μL，放入冰箱中（4 ℃）黑暗条件下保存。（2）上清液提取：每个离心管加入0.14 mol/L 磷酸盐缓冲液10 mL、乙腈10 mL，涡旋20 s，超声15 min，25 ℃、5 000 r/min 离心10 min，转移上清液于200 mL 浓缩瓶，提取过程重复2 次。将提取液在50 ℃条件下减压旋转蒸发，除去有机溶剂，待剩余溶液20～30 mL，转移至100 mL 容量瓶用双蒸水稀释至100 mL 混匀。将稀释后的溶液过0.22 μm 尼龙滤膜后，准确移取10 mL 于进样瓶，并加入Na4EDTA（乙二胺四乙酸四钠）0.005 g 混匀，待测。空白对照、加标样品以及样品平行均同时进行处理，每10 个样品之间设定一个空白样品，每20 个样品之间分析1个加标样品。。

1.3.2 测定方法 使用在线固相萃取-超高压液相色谱-质谱联用技术（On-line SPE LC-MS/MS）技术分析样品中的抗生素含量［21-23］。在线固相萃取柱采用C18 柱，分析柱：液相色谱柱 为Merk Purosphere STAR RP-18e（5 μm）250 mm×4.6 mm，流动相为乙腈（A）和0.1%甲酸-5 mmol/L 甲酸铵水溶液（B）；梯度洗脱程序：20%A 0 min，40%A 8 min，70%A 11 min，80% A 13 min，80%A 15 min，20%A 16 min；流动相流速为0.6 mL/min；柱温为30 ℃。质谱采用电喷雾离子化源（ESI）在正模式下对抗生素进行分析。雾化器压力为45 kPa；干燥气流速和温度分别设为10 L/min 和325 ℃；毛细管电压为4 000 V；碰撞能、碎裂电压（Fragmentor voltage）、母离子和子离子选择等其他质谱条件则采用Agilent 公司软件Optimizer 自动进行优化。最终所有样品均在多反应监测模式下（MRM）进行测定，采用内标法进行定量。

试验数据采用Excel 2010 与SPSS 17.0 进行处理。

2 结果与分析

2.1 不同施肥处理对玉米农艺性状及产量的影响

由表1 可知，不施肥对照玉米植株除穗长外，产量、各个时期的株高及茎粗、百粒重均显著低于施肥处理，其中复合肥处理玉米产量显著高于不施肥对照；3 个施肥处理的玉米百粒重无显著差异，说明鸡粪、猪粪、复合肥肥效基本一致，能够满足玉米生长所需；在整个生长过程中，相比于施复合肥，施有机肥（鸡粪、猪粪）能持续长期地为植物提供肥效。

表1 不同处理对玉米农艺性状及产量的影响Table 1 Effects of different treatments on agronomic traits and yields of corn

2.2 畜禽粪便对土壤磺胺类抗生素含量的影响

在试验过程中，分别在玉米生长初期（0 d）、中期（40 d）、末期（80 d）取玉米根际土壤耕层和深层样，分别测定各处理土样的磺胺类抗生素含量（表2）。由表2 可知，施鸡粪处理玉米生长初期（0 d）土壤耕层、深层土样的磺胺类抗生素总含量分别为2 160、480.2 ng/kg，施猪粪处理分别为1 275.7、454.4 ng/kg，耕层土壤起始浓度高，深层土壤的起始浓度较低；玉米生长中期（40 d），相比于生长初期土壤，各磺胺类抗生素浓度均有所降低，施鸡粪、猪粪处理的耕层土壤磺胺类抗生素含量分别降低56.14%和38.39%；玉米生长末期（80 d），施鸡粪、猪粪处理的耕层土壤磺胺类抗生素含量分别降低74.70%和51.90%。从磺胺类抗生素总含量变化来看，相比于玉米生长初期，不同施肥处理、不同生长时期（40、80 d）的耕层土壤磺胺类抗生素含量呈下降的趋势，其中施鸡粪处理的土壤表现为生长初期（2 160 ng/kg）＞生长中期（502.7 ng/kg）＞生长后期（335.4 ng/kg）；而深层土壤却呈先上升后下降的趋势，其中施鸡粪处理的土壤磺胺类抗生素浓度表现为生长初期（480.2 ng/kg）＜生长中期（655.2 ng/kg）＞生长后期土壤（332.5 ng/kg），这是由于磺胺类化合物在土壤中的吸附能力较低，大部分磺胺类化合物会被浸出到更深的土壤中［24］。

表2 玉米不同生长时期土壤磺胺类抗生素含量Table 2 Contents of sulfonamide antibiotics in the soil at different growth periods of corn（ng/kg）

2.3 渗滤液磺胺类抗生素含量的变化

从表3 可以看出，从土壤迁移到渗滤液中的磺胺类抗生素含量均较低（0～40 ng/L），且SDM、SQ 和SMD 等磺胺类抗生素在渗滤液中均未检测到。其中，玉米生长中期渗滤液中的磺胺类抗生素含量分别为生长初期的3.86%和3.79%，生长末期则分别下降到0.81%和1.33%，表明磺胺类抗生素随着玉米生长时期的推进，能够从土壤解吸到渗滤液中的磺胺类抗生素不断减少，这是由于磺胺类抗生素在生态系统中，不仅会迁移到水体中，还会被土壤吸附、植物吸收积累、光降解、微生物降解等一系列变化，是各个过程共同作用的结果［24］。

表3 玉米不同生长时期土壤渗滤液磺胺类抗生素含量Table 3 Contents of sulfonamide antibiotics in soil leachate at different growth periods of corn（ng/L）

2.4 玉米植株磺胺类抗生素含量的变化

由表4 可知，8 种磺胺类抗生素在玉米的根部均有检测到、含量范围在7.2～27.5 ng/kg，而在茎叶中只检测到部分磺胺类抗生素、且含量均较低（0.5～17.9 ng/kg），玉米果实则没有检出。施鸡粪、猪粪处理的玉米根系中的磺胺类抗生素含量分别为土壤初始含量的5.88%和5.24%，而茎叶中的磺胺类抗生素含量分别为土壤初始含量的1.93%和0.77%。由于磺胺类化合物在土壤中的吸附能力较低，大部分磺胺类抗生素会被浸出到更深的土壤或地下水中，从而降低了植物吸收的可能性［25-26］。Zhao 等［27］研究发现，与土壤中的抗生素含量相比，只有0.072%的抗生素在植物中积累。植物体内累积的抗生素含量要远低于土壤［28-30］。

表4 生长末期玉米植株各部分磺胺类抗生素含量Table 54 Contents of sulfonamide antibiotics in various parts of corn at late growth period

3 讨论

本试验中，耕层土壤磺胺类抗生素下降速率显著快于深层土壤，这可能是由于耕层土壤在表层，具有较大的光接触面与氧气来源，并且是植物根系所在的主要土壤层，通过光分解、微生物分解、植物吸收、土壤吸附、水的淋溶作用等，磺胺类抗生素降解速度快于深层土壤。抗生素的半衰期从几天（氯霉素、头孢噻呋）到300 d（土霉素、沙拉沙星）不等，许多抗生素的半衰期会在低温和黑暗中增加，这表明它们在较深的土层中持续时间更长［31-32］。在所有类型的抗生素中，磺胺类抗生素在土壤中的吸附最弱，流动性最强［33］。磺胺类抗生素可在土壤中移动，通过淋滤和侵蚀进一步向土壤深层迁移［34］。而不同土壤对抗生素的吸附效果也有很大区别，Kay 等［35］研究发现在粘土土壤中几乎没有抗生素残留。

磺胺类抗生素在土壤渗滤液中的浓度不超过40 ng/kg，且SDM、SQ 和SMD 在渗滤液中没有被检测到。前人试验表明，畜禽粪便中的抗生素大部分（高达99%）都会被保留在粪便中或施肥的土壤中，地表径流和渗滤液中的抗生素含量低于0.5 μg/L［36］。

本研究鸡粪、猪粪等畜禽粪便中的磺胺类抗生素主要在玉米的根部累积，茎叶部分的磺胺类抗生素含量较少，玉米果实中则没有发现磺胺类抗生素，这与其他研究结果相似。Yan 等［37］研究发现凤眼莲的根部是环丙沙星主要的累积组织，Michelini 等［38］研究发现磺胺嘧啶主要在柳树和玉米的根部累积。但不同类型的抗生素在作物中的累积部位可能不尽相同。Pan 等［39］研究发现四环素（TC）、诺氟沙星（NOR）和氯霉素（CAP）在作物组织中的最终分布情况表现为果实＞叶/根部＞根部，而磺胺甲氧苄啶（SMZ）和红霉素（RY）的分布则相反，表现为根部＞叶/根部＞果实。

自然分解是磺胺类抗生素的主要消散途径。本研究中，磺胺类抗生素在土壤-植物-水系统中的最终含量分布为：施鸡粪处理表现为自然分解（67.65%）＞耕层土（12.70%）＞深层土（12.59%）＞玉米根部（4.81%）＞玉米茎叶（1.58%）＞渗滤液（0.66%）＞玉米果实（0.00%），施猪粪处理表现为自然分解（42.74%）＞深层土（28.59%）＞耕层土（19.51%）＞玉米根部（6.54%）＞渗滤液（1.66%）＞玉米茎叶（0.96%）＞玉米果实（0.00%）。而相较于施猪粪处理，施鸡粪处理的深层土和渗滤液中的抗生素含量比例更低，这可能是由于不同粪便对抗生素的吸附不同导致的。Wei 等［40］也发现土壤中兽药的残留水平与粪便来源的动物种类有关，家禽粪便改良的土壤样本的抗生素污染水平相对高于牛粪和猪粪改良的土壤样本。

从玉米果实样的分析结果看，通过施用有机肥（鸡粪和猪粪等）能够得到安全的农产品（玉米）。Boxall 等［41］研究胡萝卜和莴苣兽用抗生素吸收试验结果表明，虽然在少数情况下抗生素的暴露浓度相当可观，但都以低于可接受的每日摄取量的10%，食用植物组织中大多数抗生素的浓度对人类健康的风险微乎其微。因此人类通过作物接触的磺胺类抗生素浓度可以忽略不计，但在得出具体结论之前，应进一步调查抗生素在可食作物中的积累情况，并研究长期食用含抗生素作物对人体的影响。

4 结论

本试验结果表明，玉米在不同施肥处理下均可良好生长，未出现明显的缺肥现象。相比于不施肥对照，施复合肥、鸡粪、猪粪处理均可收获正常产量的玉米产品，且畜禽粪便中的抗生素不会对玉米产生抑制毒性。在施用鸡粪或猪粪后，畜禽粪便中的磺胺类抗生素会迁移到耕层和深层土壤中，其中大部分（67.65%和42.74%）磺胺类抗生素会自然分解，少量磺胺类抗生素随着土壤的解吸进入水体中，渗滤液中的磺胺类抗生素只有土壤初始含量0.66%和1.66%。根部和茎叶是磺胺类抗生素在玉米中的主要累积部分，且根部对磺胺类抗生素的吸收效率高于茎叶部分，累积浓度为茎叶的5 倍。