猪圆环病毒2型和3型双重PCR方法的建立及在藏猪猪圆环病毒检测中的应用

朱家平， 肖 琦， 钱雯娴， 赵霞玲， 张冯禧， 尹力鸿， 温立斌， 索朗斯珠， 何孔旺

(1.西藏农牧学院动物科学学院，西藏林芝 860000；2.江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室，江苏南京 210014)

猪圆环病毒(PCV)为单链负股环状且无囊膜的DNA病毒，属于圆环病毒科圆环病毒属，结构为20面对称体，是现已知的最小的动物病毒。猪圆环病毒可分为4个型：1974年由Tischer等首次分离得到的无致病性的猪圆环病毒1型(PCV-1)；Ellis等在加拿大西部猪群中分离得到的 PCV-2；2015年美国北卡罗来纳州学者在猪群中发现的PCV-3；2019年在湖南病猪中发现的新的圆环病毒，暂定为猪圆环病毒4型(PCV-4)。其中，PCV-2能够引起严重的猪圆环病毒病，损害机体免疫系统，增大混合感染的概率，且PCV-3与猪圆环病毒相关性疾病的发生联系紧密。在我国，于2000年郎洪武等首次分离得到PCV-2；PCV-3于2017年首次被发现，之后在辽宁省、江西省、江苏省均有报道。猪圆环病毒病在世界各个国家都有报道，我国也是感染较为严重的国家，且存在PCV-2与PCV-3混合感染的情况。但目前检测PCV-2和PCV-3的PCR方法局限于单一PCR，双重PCR同时检测PCV-2和PCV-3的报道还很少。藏猪是主要分布于我国青藏高原的小型猪种，具有适应性强、抗病耐粗的特点；目前很少有关于西藏地区藏猪圆环病毒的报道。因此，建立一种快捷、灵敏、可靠的双重PCR方法检测并区分PCV-2和PCV-3，对临床诊断和防控猪圆环病毒病具有深远意义。本试验旨在建立一种具有较高灵敏度的、能够同时检测PCV-2与PCV-3的双重PCR方法，并对西藏地区临床健康藏猪进行检测，从而为西藏地区PCV的流行病学调查提供依据。

1 材料与方法

1.1 病毒株、菌株与临床样品

大肠杆菌Trans5α、PCV-2和PCV-3阳性病料、PCV-1、猪瘟病毒(CSFV)、猪呼吸道疾病综合征(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)等常见猪源病原均由江苏省农业科学院兽医研究所保存。47份藏猪粪便样品于2020年6月采集于西藏林芝周边地区。

1.2 试验时间及地点

本试验于2020年7—10月在江苏省农业科学院兽医研究所、农业部兽用生物制品工程技术重点实验室完成。

1.3 主要试剂

Green Taq Mix购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；DL-2000 DNA marker、pClone007 Simple Vector Kit、琼脂糖购自北京擎科生物科技有限公司(南京)；DNA提取试剂盒购自广州美基生物科技有限公司；胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒均购自美国Omega公司；引物合成和测序均由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

1.4 引物的设计与合成

用笔者所在实验室已有的引物序列检测 PCV-2 和PCV-3，PCV-2检测引物为PCV-2-SF(5′-G G T T A G A C G G A T A T T G T A G T C C-3′)和 PCV-2-SR(5′-C G T T T C C G C A G A A G A A G A C A C-3′)，扩增长度为630 bp；PCV-3检测引物为PCV-3-A2-U(5′-C A G C T G T G G G C C T C C T A A T G A A T-3′)和 PCV-3-A2-L(5′-C C C C C G T G G C T T G A A A T A C A G-3′)，扩增长度为932 bp。

1.5 临床样品处理与病毒DNA提取

取适量粪便装入干净的EP管中，向管中加入2倍体积的0.01 mol/L无菌PBS(pH值7.0)，制成悬浮液，反复冻融3次；将冻融的样品于4 ℃下 10 000离心5 min，取上清于EP管中，用Magen生物公司的组织DNA抽提试剂盒，按说明书中的步骤提取样品核酸作为模板。

1.6 单一PCR扩增

以提取的DNA为模板，用PCV-2-SF、PCV-2-SR、和PCV-3-A2-U、PCV-3-A2-L引物进行PCR扩增。2型最适PCR体系为25 μL：2 μL模板，1 μL的上游引物，1 μL的下游引物，2×mix 12.5 μL，无菌水8.5 μL；最适反应条件：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，扩增35个循环；72 ℃延伸7 min。3型最适PCR体系为25 μL：1 μL模板，1 μL的上游引物，1 μL 的下游引物，2×mix 12.5 μL，无菌水9.5 μL；最适反应条件：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，53.6 ℃退火30 s，72 ℃延伸65 s，扩增35个循环；72 ℃延伸7 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测并观察扩增结果。

1.7 PCV-2和PCV-3阳性质粒的制备

用引物PCV-2-SF、PCV-2-SR、和PCV-3-A2-U、PCV-3-A2-L阳性样品进行PCR扩增，得到相应的特异性条带，将目的条带进行切胶回收，用pClone007 Simple Vector Kit 进行TA克隆，将克隆送至北京擎科新业生物技术有限公司进行测序，并将含有目的片段的质粒作为阳性质粒。

1.8 双重PCR扩增条件筛选

在单重PCR的基础上，筛选双重PCR的最适退火温度、循环数、引物浓度，确定双重PCR的最适反应条件，并验证其特异性和敏感性。

1.9 双重PCR的敏感性试验

计算PCV-2、PCV-3的初始质粒浓度，并将其进行倍比稀释，用已建立好的最适单重PCR条件和双重PCR条件对不同浓度的阳性标准物进行检测，来确定双重PCR的敏感性。

1.10 双重PCR的特异性试验

用建立的方法对PCV-2、PCV-3和PCV-2与PCV-3混合物以及实验室保存的其他常见病原进行检测，验证此方法的特异性。

1.11 双重PCR重复性试验

在摸索双重PCR最适条件时，不同条件均做3组重复，降低试验结果出现偶然性，并用建立的方法对3份PCV-2阳性样品DNA、3份PCV-2阴性样品DNA、3份PCV-3阳性样品DNA、3份PCV-3阴性样品DNA等一些其他病原检测1次/周，重复检测3次，验证双重PCR的重复性。

1.12 临床检测与统计分析

收集2020年6月西藏林芝市周边地区藏猪粪便47份，用Magen生物公司的DNA抽提试剂盒按照说明书对其进行DNA提取，用单重PCR和建立的双重PCR的方法对样品中PCV-2和PCV-3进行检测，并用Rstudio 1.2.5033软件对检测结果进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 PCV-2和PCV-3阳性质粒的制备

用PCV-2和PCV-3的引物对病料核酸进行PCR扩增，分别得到630、932 bp特异性条带，与预期相符。切胶回收后进行TA克隆、质粒提取，再次PCR验证均可获得特异性条带，表明成功构建 PCV-2 和PCV-3阳性质粒(图1)。

2.2 双重PCR扩增条件优化

2.2.1 双重PCR退火温度的优化 以PCV-2和PCV-3单重PCR检测方法为基础，选取合适的模板浓度，设置4个温度(53、54、55、56 ℃)作为退火温度进行双重PCR的扩增，用1%琼脂糖凝胶电泳观察扩增，结果发现双重PCR在54 ℃时PCV-2和PCV3的扩增效果最好，故确定最适退火温度为 54 ℃(图2)。

2.2.2 双重PCR循环数的优化 以54 ℃为双重PCR的退火温度，选取合适的模板浓度，设置3个不同循环(30、35、40)对双重PCR最适循环数进行验证，结果发现在循环数为40时条带亮度较为合适，因此选用40个循环为PCR的最适循环数(图3)。

2.2.3 双重PCR引物浓度的优化 设置0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 μL等5个引物量(上下游引物浓度均为1×10pmol/μL)对PCV-2/3单重PCR的最适引物量进行摸索。结果发现，PCV-2和 PCV-3 均在引物量为0.5、1.0、1.5 μL时条带已足够亮(图4、图5)。以0.5、1.0、1.5 μL为双重PCR的引物量，以棋盘滴定法找到双重PCR中 PCV-2 与PCV-3初始最适引物体积比例为2.0、0.5 μL(图6)。并按照该引物体积比例设置3组引物量(1.2 μL ∶0.3 μL；1.6 μL ∶0.4 μL；2.0 μL ∶0.5 μL)确定双重PCR中PCV-2与PCV-3的最终最适引物体积比例为1.6 μL ∶0.4 μL(图7)。

2.3 双重PCR敏感性试验结果

将70.7 ng/μL PCV-2、62.5 ng/μL PCV-3的阳性质粒均稀释成10拷贝数/μL，按比例混合稀释为10拷贝数/μL，之后进行倍比稀释来进行PCR的敏感性试验。经敏感度测定发现，优化后的双重PCR敏感度和其单一PCR的敏感度相同，均为10拷贝数/μL，说明建立的双重PCR检测方法具有很高的敏感度(图8、图9、图10)。

2.4 双重PCR特异性试验

以优化后的双重PCR对PCV-2、PCV-3、PCV-2+ PCV-3以及PCV-1、CSFV、PPV、PRV、PRRSV、PEDV进行检测。结果显示，本试验建立的方法对PCV-2、PCV-3、PCV-2+PCV-3均能扩增出目的条带，对其余病原均无特异性目的条带，虽PRV出现较弱非特异性条带，但与目的条带距离较大，并不影响对PCV-2与PCV-3的判定结果。表明建立的双重PCR的方法具有较好的特异性(图11)。

2.5 双重PCR重复性试验

在摸索双重PCR最适条件时，3组重复均大致相同，且利用建立的双重PCR方法分别对PCV-2阳性样品DNA、PCV-2阴性样品DNA、PCV-3阳性样品DNA、PCV-3阴性样品DNA以及其他病原进行检测，3次重复结果一致，说明建立的PCV-2、PCV3双重PCR方法具有很好的重复性。

2.6 临床检测与统计分析

以单重PCR和建立的双重PCR分别对采集的47份临床样品进行PCR扩增，发现双重PCR与单重PCR结果一致。利用RStudio对结果进行分析并做可视化处理，PCV-2、PCV-3的阳性率分别为38.30%(18/47)、12.77%(6/47)，混合感染率为10.64%(5/47)，单患PCV-2率为27.7%(13/47)，单患PCV-3率为2.1%(1/47)，PCV-2和PCV3双阴性率为59.6%(28/47)(图12)。

3 讨论与结论

自PCV-2和PCV-3报道以来，国内外均有猪群感染的情况，且感染率居高不下，存在混合感染现象。PCV-2和PCV-3在临床上均表现为繁殖障碍、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、猪皮炎肾病综合征(PNDS)、能够引起猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、仔猪先天性震颤、增生性坏死性肺炎(PNP)等，在临床上无法明确区分PCV-2和PCV-3。另有报道在无临床症状的猪和犬中检测到PCV-3，且PCV-3能跨种间传播，在牛、蜱、鼠中亦能检测到，但PCV-2和PCV-3无交叉免疫保护，PCV-2的疫苗无法防止PCV-3的感染，猪圆环病毒不仅给世界养猪业带来严重损失，也可为其他动物的健康带来严重威胁，增加防控难度。因此，建立敏感性高、特异性强、重复性好的诊断方法对PCV-2和PCV-3临床检测与防控具有重要意义。

PCR为实验室检测的常用技术，肖琦等分别建立了PCV-2和PCV-3 PCR检测技术，但单重PCR技术1次只能检测1种病原。多重PCR方法于1988年提出，该方法在疾病混合感染方面具有快速、省时、省力的优势，既具有单项PCR的敏感性和特异性，又可节省试剂，1次检测多个病原体或多个基因型，具有很高的实用性。季程远等建立的双重PCR方法中PCV-2和PCV-3检测敏感度分别为1×10、1×10拷贝数/μL，6.1×10、8.0×10拷贝数/μL。本研究通过对PCR不同条件的优化和反复试验，最终建立了简单快速、灵敏稳定、准确可靠的PCV-2和PCV-3双重PCR方法，其灵敏度和单重PCR相同均为1×10拷贝数/μL，且高于已报道的PCV-2、PCV-3双重方法的敏感度。

目前，我国PCV-2和PCV-3在很多省份均有报道。PCV-2感染率为23.53%～81.40%(青海省为23.53%、云南省为36.05%、江苏省为38.00%、吉林省为38.50%、京津冀为56.70%、广西壮族自治区为65.10%、新疆维吾尔自治区为70.71%、四川省为74.48%、河南省为81.40%)；PCV-3感染率为11.10%～38.3%(广西壮族自治区为11.10%、四川省为11.19%、江苏省为12.67%、云南省为17.44%、青海省为18.38%、新疆维吾尔自治区为20.00%，河南省为30.23%，京津冀为38.30%)，混合感染率为 6.64%～30.23%(广西壮族自治区为7.90%，京津冀为17.50%，青海省为7.35%，河南省为30.23%，四川省为6.64%，云南省为15.12%)。本研究建立的双重PCR方法对临床健康的藏猪粪便进行猪圆环病毒检测，结果PCV-2感染率为38.3%(18/47)，PCV-3感染率为12.8%(6/47)，混合感染率为10.6%(5/47)。从目前我国PCV-2和PCV-3的感染类型来看，PCV-2、PCV-3 阳性率大致为53%、20%，混合感染率为14.12%左右，可见PCV-2、PCV-3在我国已普遍流行，且PCV-3多与PCV-2以混合感染的形式存在。从PCV-2和PCV-3感染地区来看，中国北部地区PCV-2和PCV-3阳性率较高，这可能与南北方气候差异有关。本试验以西藏林芝周边临床健康猪为检测对象，对其粪便进行检测。整体来看，西藏林芝地区PCV-2和PCV-3感染率相对较低，这可能与藏猪的散养模式、耐受能力和高原气候有关，且PCV-3多与PCV-2混合感染，但也存在PCV-3单独感染的现象，存在隐性感染的可能，因此西藏养殖户应加强对猪圆环病毒的防控意识。