6种细菌对苹果炭疽叶枯病病菌的抑制作用

于占晶， 侯晓杰， 高群英， 孙文清， 刘海鹏， 梁魁景

(衡水学院生命科学系，河北衡水 053000)

我国是苹果生产第一大国，苹果种植面积和产量均位于世界首位，是具有明显国际竞争力的农产品之一。苹果病害的发生给果农造成重大损失，苹果炭疽叶枯病是近年来发生在苹果叶片和果实上的一种病害，也是目前流行速度最快的一种病害。此病害最早在巴西发现，后在美国也有发生。我国于2010年首次在江苏省徐州市丰县发现此病害，目前，在山东、河南、江苏、安徽、河北等各大苹果产区都有发生。李保华教授对病菌进行分离、培养和鉴定，确定该病是由炭疽菌引起的。该病菌在果苔枝和一年生的瘦弱枝上越冬，5月当气温超过 15 ℃，枝条润湿超过48 h，越冬病菌开始产孢，进行初侵染，8月中下旬达发病高峰，发病时叶片呈现干枯的棕褐色病斑，枯叶如同被水烫过一样，高温高湿条件下，病斑扩展迅速，病重叶片很快脱落。果实发病时呈现圆形褐色凹陷病斑，病斑周围有红色晕圈，病斑下果肉呈褐色海绵状，深约 2 mm，严重时病果率达100% 。10月份随气温下降，发病减缓。

目前生产上对于苹果炭疽叶枯病的主要防治方法有：一是合理疏枝，使果园具有较好的透风性；二是利用化学农药进行治疗，防止病菌大范围侵染。但在实际应用中栽培措施见效慢，防治过程中只可起到辅助作用；化学防治方法对于果实有严重的农药残留，对人体健康产生危害。因此，采取一种高效、无毒、无污染的防治策略将成为研究防治苹果炭疽叶枯病的重中之重。生物防治成为新的研究热点，国内已有一些植物内生菌、土壤中筛选拮抗菌的研究，陈照等发现HAB-9菌株对槟榔炭疽病病菌等植物的抑菌作用有很大的不同，平均抑制率达到60.72%；抑制槟榔炭疽菌的效果相对明显，平均抑制率达到70.60%；对黄瓜炭疽病病菌的抑制效果最不突出，抑菌率是50.21%。笔者从苹果、姜中分离出一些内生菌菌株，并从健康果园土壤中分离得到一些菌株，经过初筛得到6株对苹果炭疽叶枯病病菌有抑制作用的菌株，本研究旨在通过进一步抑菌测定明确这6个菌株对病原菌的抑制效果，为下一步防治打下理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试细菌 J4(枯草芽孢杆菌，)、J6、T4、T7、P2、ZJ01(解淀粉芽孢杆菌，)，由衡水学院生命科学系园林植物学实验室提供，其中J4、J6从姜中得到，T4、T7从健康苹果园土壤中分离得到，P2从苹果中分离得到，ZJ01从枣叶片中分离得到，部分菌株还未鉴定。

1.1.2 供试病原菌 苹果炭疽叶枯病病菌()，由衡水学院生命科学系园林植物学实验室提供。

1.1.3 供试培养基 采用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基和营养琼脂(NA)培养基对苹果炭疽叶枯病病菌和几种细菌进行培养。

1.1.4 试验时间和地点 试验于2020年在衡水学院园林植物实验室进行。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌活化培养 从冰箱中取出备用细菌，用划线法在NA培养基上活化培养，用灭过菌的接种环蘸取细菌甘油溶液，“之”字形划线到培养基上，置于28 ℃恒温生化培养箱中培养4～5 d，备用。

1.2.2 苹果炭疽叶枯病病菌的复壮 将保存在冰箱中的苹果炭疽叶枯病病菌在PDA培养基上进行活化，倒置于28 ℃恒温生化培养箱中培养4～5 d，观察病原菌的生长状况，备用。

1.2.3 苹果炭疽叶枯病病菌菌丝生长的抑制测定 采用对峙培养法：在超净工作台上，用直径为 6 mm 的打孔器打取苹果炭疽叶枯病病菌菌落，倒置于PDA平板中央，用接种环蘸取细菌，在距离病原菌菌饼上下2.5 cm的地方分别划线，每种细菌重复3次，同时设置空白对照。于28 ℃恒温生化培养箱中倒置培养，48 h开始测量记录数据，每隔24 h记录1次，培养至5 d。观察菌落生长情况，在距离菌饼中心左右各1 cm的地方分别测量抑菌带的宽度求平均值，计算菌丝生长抑制率。

抑菌率=(对照菌落直径-处理抑菌带宽度)/对照菌落直径×100%。

1.2.4 苹果炭疽叶枯病病菌孢子萌发的抑制测定 孢子悬浮液的制备：取培养5～7 d的苹果炭疽叶枯病病菌，加入10 mL无菌水，用灭菌玻璃涂菌环轻轻地将病原菌的孢子刮到无菌水中，用滤纸过滤摇匀，在10×10倍的显微镜下观察孢子数量，每个视野约有50～60个孢子为宜，备用。

抑菌圈法测定病原菌孢子萌发：用移液枪吸取200 μL孢子悬浮液加到凝固的PDA平板上，用玻璃涂菌环涂抹均匀，晾干，用直径为6 mm打孔器分别打取细菌菌落，将菌块倒扣接种到PDA平板中央。置于28 ℃恒温生化箱中培养，培养48 h开始测量记录数据，每隔24 h记录1次，培养至5 d，用十字交叉法测量抑菌圈直径。

1.3 数据处理

应用Excel 2010软件处理数据，用SPSS 16.0软件进行方差分析，差异显著性水平为5%(<0.05)。

2 结果与分析

2.1 6种细菌对苹果炭疽叶枯病病菌菌丝生长的影响

如图1所示，随着培养时间的延长，作为对照的苹果炭疽叶枯病病菌菌落直径逐渐增加，6种细菌对病原菌的菌丝生长均表现出了不同程度的抑制作用，均产生抑菌带且抑菌带宽度不等。T4处理产生的抑菌带宽度最小，相对抑制效果最好，其次是T7、P2、ZJ01、J6，效果相对较差的细菌是J4。随着时间的延长，菌落直径有所增加，但增长幅度较小。

2.2 6种细菌对苹果炭疽叶枯病病菌菌丝生长的抑制作用

6种细菌对苹果炭疽叶枯病病菌均有抑制作用，产生了明显的抑菌带，抑菌带宽度不同抑制率也有所不同(图2)。由表1可见，6种细菌对苹果炭疽叶枯病病菌菌丝生长的抑制效果不同，与对照之间均有显著性差异。其中T4的抑制效果最好，抑菌率高达64.10%， 除与T7差异不显著外， 与其他几种细菌之间都有显著差异；T7、 P2、ZJ01、J6抑制效果次之，抑菌率分别为61.54%、60.64%、60.26%、59.83%，它们之间无显著性差异；J4抑制效果相对较差，但抑菌率也达到了58.59%，与T4和T7抑菌率差异显著，与其他细菌之间无显著性差异。

表1 6种细菌对苹果炭疽叶枯病菌菌丝生长的抑制率

2.3 6种细菌对苹果炭疽叶枯病病菌孢子萌发的影响

如图3所示，6种细菌对病原菌的孢子萌发表现出了不同的作用，对照长满培养基表面，6种细菌处理下均有抑菌圈产生，但直径大小不同。ZJ01抑菌圈直径最大，T7、T4、J4、P2稍差，J6直径最小。随着培养时间的延长，J4处理下抑菌圈直径几乎无变化，P2直径先增大后减小，其他几种细菌处理下抑菌圈直径有增长的趋势，但增长缓慢，说明6种细菌对病原菌孢子萌发能产生抑制作用，且能保持抑制性。

2.4 6种细菌对苹果炭疽叶枯病病菌孢子萌发的抑制作用

6种细菌对苹果炭疽叶枯病病菌均产生了抑制作用，有抑菌圈产生(图4)，其中ZJ01、T7、T4、J4和P2抑菌圈透明，边缘清晰，J6抑菌圈边缘模糊，抑菌圈不明显。

对培养至5 d的抑菌圈直径进行方差分析，结果见表2。对照长满了菌落，ZJ01、T7、T4、J4、P2对苹果炭疽叶枯病病菌孢子萌发均有较好的抑制作用，抑菌圈直径分别为为2.58、2.42、2.37、2.32、2.30 cm，它们之间无显著性差异，与J6和对照之间差异显著。J6抑制效果较差，抑菌圈直径仅为 1.20 cm，与其他菌株和对照均有显著性差异。

表2 6种细菌对苹果炭疽叶枯病病菌的抑菌圈直径

3 结论与讨论

在绿色防控理念的指导下，安全、高效、无残留毒性的生物防治成为国内外学者的研究热点，认知真菌的传播规律，积极采取以预防为主的措施可以切断病原快速传播的途径。苹果炭疽叶枯病是一种新兴病害，对此病菌生物防治的研究现在尚处于起步阶段。本研究测定了6种生防细菌对苹果炭疽叶枯病病菌的抑制作用，得出T4、T7、P2、ZJ01、J6、J4对苹果炭疽叶枯病病菌菌丝生长抑制效果较好，尤其是T4和T7，抑制率分别高达64.10%和61.54%；而ZJ01、T7、T4、J4、P2对孢子萌发具有较好的抑制作用，其中ZJ01、T7、T4抑制圈平均直径分别为2.58、2.42、2.37 cm。且这6个菌株对病原菌的抑制作用持续性较强，随着时间的延长，抑制效果并未减弱。综合分析显示，T4和T7对菌丝生长和孢子萌发均表现出了较好的抑制效果，这2个菌株均是从健康苹果园土壤中分离得到的，这与前人一些研究结果类似。韩雨桐等从小麦根际土壤中分离获得一株拮抗细菌Sc2，对稻瘟病病菌抑菌率达73.44%。刘力伟等发现荧光假单胞菌SS101菌株对不同苹果产区9株病原菌的菌丝生长和孢子萌发具有显著的抑制作用，在田间对再植病害也有良好的防控效果。

近年来国内外广泛利用拮抗微生物及其代谢产物来抑制病原菌的生存和活动，其中拮抗细菌因其自身种类和数量多、对病原菌作用方式广、繁殖速度快等特点在植物病害防治中起到非常重要的作用。有研究发现枯草芽孢杆菌对苹果轮纹病、桃和油桃褐腐病、西瓜枯萎病等都有明显的抑制效果。下一步会利用菌体形态和菌落特征观察、生理生化试验和16S rDNA序列同源性分析，对T4和T7菌株进行分类鉴定，同时对这2个菌株进行发酵条件的优化，研究代谢产物对病害的生防效果，为后续T4和T7菌株的工业化开发及田间应用奠定基础。