通过链脲佐菌素诱导建立糖尿病骨质疏松大鼠模型的实验研究进展

孙立亚刘北奚悦

(1. 辽宁中医药大学,沈阳 110847;2. 锦州医科大学附属第三医院,辽宁 锦州 121001)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种以高血糖为特征的常见病,在世界范围内发病率较高。 预计到2030 年,世界人口约为85 亿,而全球糖尿病患病率将达到9%[1],这意味着大约有7.65 亿人患有糖尿病。 与非糖尿病人群相比,这些人的死亡率有所增加,例如,冠心病死亡率增加了28%[2]。 糖尿病骨质疏松症(diabetic osteoporosis,DOP)是其严重并发症之一,临床多表现为疼痛、相应部位功能活动障碍、畸形、甚至骨折等,患者生命质量大大降低[3]。 Oei 等[4]发现DM 患者的骨折发生率比非DM 患者高47% ～ 62%。 因此建立稳定、简便、高效的DOP 动物模型是寻找治疗DOP 新药的重要保证。 目前DOP 建模的方法有三种,分别是诱导型、自发型和转基因/基因敲除型[5],其中链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导型因其相对便宜、高效、简便而被经常运用,然而,STZ 致糖尿病也是多因素的,取决于各种实际方面,如动物种类、性别、年龄、STZ 的稳定性、给药途径和剂量等[6]。 下面就STZ诱导建立DOP 大鼠模型的方法及相关研究进展进行综述,旨在为科研及临床相关研究提供进一步的指导。

1 动物选择及饲料喂养

斑马鱼[7]、羊[8]、兔[9]、猪[10]、大鼠[11]、小鼠[12]等是常用于制作骨质疏松模型的动物,由于大鼠与人类骨骼的病理生理相似且比较经济、重复检验度高,所以多采用大鼠制作DOP 动物模型[13],SD 和Wistar 大鼠应用最广。 STZ 易受雌激素干扰[14],雄性的胰岛β 细胞比雌性更容易受到STZ 诱导的细胞毒性,对胰岛细胞毒素更加敏感,且选用雄性大鼠制备模型的成模率明显高于雌性大鼠,此外雄性大鼠可排除雌激素这一因素对疾病的干扰,因此雄性动物更受欢迎[15]。 在制备DOP 模型时,为提高成模率,部分选择雌性大鼠的研究者为排除雌激素干扰,还会对大鼠去卵巢[16-19]。 大鼠寿命一般为2～3 年,在3 月龄达到性成熟,6 月龄达到骨成熟,17 月龄以后进入老年时期。 因1 型糖尿病骨质疏松症(type 1 diabetic osteoporosis,T1DOP)多发生于青少年,故多选择小于3 月龄大鼠制作模型,2 型糖尿病骨质疏松(type 2 diabetic osteoporosis,T2DOP)模型大鼠多选用3 月龄及以后的。

高糖和高脂是糖尿病发病因素,高糖高脂饲料可模拟人肥胖、胰岛素抵抗和/或糖耐量不足等状态,实验员在通过STZ 诱导建立T2DOP 模型时,先将大鼠或小鼠适应性喂养1 周,再予高糖高脂或者高脂饲料喂养以诱导胰岛素抵抗,为注射STZ 作前期准备。 高糖高脂饲料未有统一的配制方法及材料组成。 目前主要有两类,一种是在普通饲料的基础上添加一定比例的动物油、糖、胆固醇、胆酸盐等,成分比例多为10% ～ 20%猪油、10% ～ 20%蔗糖、1.5% ～ 5%胆固醇、0.4% ～ 1%胆酸盐、60% ～80%普通饲料、5% ～ 10%其他[20-21]。 另一种为纯化饲料,其细分了各组分营养物质的配比,配方明确规范,但价格昂贵。 除了种类,各高脂饲料的脂肪比也不同,通常认为脂肪供能比30% ～ 50%为高脂饮食,而大于50%被认为是极高脂肪饮食[22]。 王继等[23]发现高脂饲养的时间对建立糖尿病大鼠模型的特征有较大影响,喂养时间的长短和胰岛素抵抗程度、血脂异常程度正相关,和STZ 用量负相关,但需根据饲料脂肪比、动物生命周期、慢性并发症的发展及后续实验具体情况来确定具体时间,建议4 ～ 12 周为宜[24]。

2 STZ 的应用

STZ 是一种广谱抗生素,本质是一种氨基葡萄糖一亚硝基脲,能通过GLUT2 葡萄糖转运蛋白进入细胞内。 在用于诱发糖尿病的几种可用化学物质中,STZ 最适合在动物中模拟人类糖尿病。 在STZ诱导的糖尿病中观察到的结构、功能和生化变化类似于人类糖尿病中通常出现的变化。 因此,STZ 诱导的糖尿病代表了一种临床相关模型,用于研究实验动物中糖尿病的发病机制和相关并发症[25]。 其引发糖尿病的机制与一氧化氮与亚硝化应激、乌头酸酶抑制、活性氧与氧化应激、DNA 烷基化、OGlcNA 酶抑制、高血糖状态和葡萄糖代谢途径、炎症和细胞存活途径、NAD+/ATP 耗竭和过度刺激的DNA 修复机制等有关[26]。 其致糖尿病特性表现为选择性破坏β 细胞、胰岛素缺乏、高血糖、多饮和多尿,与人类糖尿病相似[27]。

目前相关实验研究所用的STZ 品牌多为Sigma,纯度≥ 98%,对于其他品牌、纯度以及不同品牌、纯度STZ 对成模效果的具体影响需要我们进一步研究。 既往报道称[28],STZ 应储存在-20℃以防止降解,称重后,装有STZ 样品的微量离心管必须用铝箔覆盖以避光。 由于STZ 在溶液中不稳定,即使在酸性pH 值下,也只能在即将注射前将其混入柠檬酸盐缓冲液中。 STZ 溶液应在溶解后5 min内新鲜制备并注入,因为15 ～ 20 min 内它在柠檬酸盐缓冲液中分解。

STZ 的给药途径可决定糖尿病诱导程度,酶对STZ 的降解和肠道的强酸性环境限制了其通过口服途径给药,可以通过尾静脉、腹腔、皮下将STZ 注射到大鼠体内。 Takeda 等[29]选用尾静脉注射STZ 来造模,黎娅等[30]、Tay 等[31]研究发现尾静脉注射STZ 比腹腔注射有更好的稳定性,且更直观,可以避免腹腔注射时药物进入皮下、肠道,降低大鼠死亡率增加的风险。 此外,黄波等[32]发现尾静脉注射成模率远大于腹腔注射,推测可能与药物的吸收利用更直接有关。 然而,张汝学等[33]、沈亚非等[34]研究证实两种方式的成模率相差不大。 由于尾静脉注射药物利用率高,对剂量的准确性要求较高,且尾静脉较细,不易操作,易造成药物损耗,不易控制速度,皮下注射需要药物剂量较大,故多选用腹腔注射给药。

因禁食可增加胰岛细胞对STZ 的敏感性,与不禁食组相比糖尿病成模率更高[35],所以,研究人员在注射STZ 之前将大鼠禁食,但具体的禁食时间4～24 h 不等[36-38]。 叶桐江等[39]通过实验观察不同禁食时间(12、16、20、24 h)对建立1 型糖尿病大鼠模型的影响,结果显示禁食20 h 大鼠成模率最高,死亡率较低,为最佳禁食时间。 Furman 等[28]认为,在注射STZ 之前大鼠应禁食6 ～ 8 h。 STZ 给药可能导致大量β 细胞的快速破坏和肝糖原存储的消耗,进而导致释放到血液中的胰岛素增加和短暂的低血糖,如果不予干预,可能会使动物致命,此时可通过在STZ 施用后48 h 内向动物施用10%蔗糖溶液来避免这种情况[40]。

STZ 的剂量和给药次数是其致糖尿病作用程度的决定因素。 在注射时,通常分为大剂量单次、小剂量多次、小剂量单次。 其中大剂量单次,如一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg,则直接损伤胰岛β 细胞,更倾向于T1DOP 的表型特点[41],主要用于T1DM 的药物实验,小剂量多次主要用于胰岛坏死及增殖机制的研究[42],和前者相比,能更好的的模拟T1DM 的发病过程,使死亡率降低,但工作量和总误差大,造模周期较长[43]。 小剂量单次注射STZ 如35 mg/kg,常应用在给大鼠喂养高糖高脂饮食之后,辅助部分破坏胰岛β 细胞,使机体失去足够的代偿能力,更接近于T2DOP 模型[44]。 然而,剂量也因种间差异而变化。 在较低剂量时,可能不会诱发理想的糖尿病,高剂量时,可能会引起动物死亡。 因此,STZ 的剂量应根据个体动物的体重进行优化,以获得令人满意的糖尿病模型,并且没有显著的死亡率。

综上,通过STZ 诱导建立DOP 模型在实验开始前一定要做好充分的准备工作,注意STZ 的作用功效、储存方法、给药方式、给药剂量、禁食时间等,建立出适合自己实验的模型。

3 造模方法、成模标准及检测指标

3.1 1 型糖尿病骨质疏松模型

何佳等[45]选用体重(230 ± 10)g 的8 周龄雌性SD 大鼠,适应性饲养1 周后,模型组采用单次左下空腹腹腔注射STZ 60 mg/kg 建立T1DOP 动物模型。 造模72 h 后,大鼠尾静脉取血,当随机血糖 ≥16.7 mmol/L,并出现多饮多食多尿症状时,符合糖尿病诊断标准,判定为糖尿病大鼠。 造模成功8 周后处死大鼠,收集血清检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活力,对胰腺和股骨组织进行病理学观察,并对股骨组织进行形态计量学测定。 结果与正常组大鼠相比,模型组血糖、进食量与饮水量明显升高,而体重显著降低,胰岛细胞形状不规则、边界模糊、体积缩小,股骨骨小梁稀疏,出现不同程度的断层,骨小梁厚度及面积百分率显著降低、间距显著增加,血清中ALP 活力极显著上升。该模型符合T1DOP 成模动物诊断标准。 证明腹腔一次性快速注射STZ 60 mg/kg 8 周后可成功构建T1DOP 动物模型。

张丽媛等[46]选取体重(201 ± 20)g 的3 月龄雄性SD 大鼠,常规饲料喂养1 周,第1 周末禁食12 h后,进行腹腔注射STZ 60 mg/kg,注射部位选择在下腹部后1/3 处避开中部膀胱。 造模72 h 后,以随机血糖≥ 17.6 mmol/L 作为成模标准。 分别于造模成功后1、4、8、12、16 周各随机选取6 只糖尿病模型大鼠和周龄相匹配的6 只对照组大鼠麻醉处死,检测指标。 从血糖、体重、骨密度(bone mineral density,BMD)、骨组织形态计量学(骨小梁面积、骨小梁厚度、骨小梁数量及骨小梁分离度)证实该方法可以成功制备T1DOP 大鼠模型。 在第4 ～8 周模型骨质疏松相关指标变化最快,此方法成模率高,模型稳定。

An 等[47]选用8 周龄雄性SD 大鼠,禁食不禁水后对大鼠腹腔注射STZ 60 mg/kg 体重。 糖尿病的诊断是基于空腹血糖 ＞ 11.1 mmol/L。 在注射STZ后3 周,收集血液、尿液、股骨和胫骨。 测定葡萄糖、胰岛素、Ca、P、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartrateresistant acid phosphatase-5b,TRACP-5b)、组织蛋白酶K 和骨钙素(osteocalcin,OC)的浓度以及脱氧吡啶啉的水平。 对股骨进行生化分析和组织学分析。结果显示,与正常组比较,糖尿病大鼠体重、股骨和胫骨的重量降低,血清Ca 和P 水平存在显著差异,OC 水平显著降低;相反,TRACP-5b、组织蛋白酶K和尿脱氧吡啶啉的活性水平显著增加。 糖尿病大鼠的BMD 和骨矿物质含量(BMC)显著降低。 胫骨近端的干细胞具有更多的TRAP 阳性细胞。 骨小梁厚度和破骨细胞数量显著减少。 该实验证实了注射STZ 后3 周DOP 模型即可成立。

综上,T1DOP 动物模型在制备过程中通常不需要进食高糖高脂饲料,适应性喂养一周后直接选用腹腔单次注射大剂量STZ 60 mg/kg 使其胰岛细胞破坏的方法复制模型,此方法目前证实最快3 周即可造模成功,可根据血糖升高,进食量、饮水量、尿量增多,体重减轻,骨重降低,血清Ca、P、OC 水平降低,TRACP-5b、组织蛋白酶K 和尿脱氧吡啶啉增加,ALP 活力极上升,TRAP 阳性细胞增多,胰腺、股骨组织病理结构损伤,BMD、BMC 降低,骨组织形态计量学参数如骨小梁面积、数量减少,厚度降低,分离度增加等指标变化来评价模型效果。 未来需进一步研究出建立T1DOP 模型的最佳造模方法,确定最适STZ 剂量及成模金标准,建立出一套用来评价模型稳定性、安全性、高效性的评价体系。

3.2 2 型糖尿病骨质疏松模型

研究发现,高糖、高脂饮食可以在不改变胰岛素受体亲和力的情况下导致胰岛素受体总体减少[48],诱导出糖尿病患者前期的肥胖、胰岛素抵抗和/或葡萄糖耐受不良状态,低剂量STZ 可以特异性地损伤少量胰岛细胞[28,49]。 高糖高脂肪饮食联合低剂量STZ 诱导的糖尿病大鼠模型是2 型糖尿病的常见模型,也是区别1 型或2 型糖尿病的关键点,具有经济、高效、稳定等特点。 近年来,许多学者利用该模型研究了T2DOP,发现糖尿病大鼠出现了骨代谢异常和严重的骨质流失。

张燕等[50]选用体重(200 ± 24)g 的雄性SD 大鼠,模型组高糖高脂饲料(10%猪油、20%蔗糖、2%胆固醇、1%胆酸钠、67%普通饲料)喂养5 周后禁食12 h,一次性左下腹腔注射STZ 35 mg/kg,72 h 后测随机血糖 ≥ 16.7 mmol/L 为造模成功。 造模4 周后检测糖脂代谢和骨代谢相关指标,结果显示与正常对照组比较,糖尿病组大鼠体质量下降、空腹血糖明显升高,并呈持续状态;血胆固醇、三酰甘油、ALP、空腹胰岛素、胰岛素抵抗指数明显升高,胰岛素敏感指数下降;血清P、Ca、OC、Ⅰ型胶原交联C末端肽与正常组比较无显著性差异;骨小梁稀疏、变细,数量减少,间隙增大,连续性破坏,常见游离断增多;骨密度明显下降。 说明高糖高脂喂养5 周基础上联合小剂量STZ 35 mg/kg 在造模后4 周可以诱导T2DOP 大鼠模型。 该模型具有高糖、高脂、胰岛素抵抗及骨密度下降,骨形态学检查呈骨吸收增加改变的特点。

唐辉等[51]选择体重(238 ± 12)g 的7 周龄雄性SD 大鼠,模型组采用高脂高糖饲料(配方不明)喂养4 周,按35 mg/kg 一次性腹腔注射STZ 诱导T2DOP 模型。 于STZ 注射后3、7、10、14 d、21 d 测量模型组大鼠空腹血糖,连续3 次测得空腹血糖均≥ 16.7 mmol/L,则为糖尿病造模成功。 8 周后取材发现与对照组大鼠比较,模型组大鼠在注射STZ后,体重呈现出先下降、后稍回升的趋势;大鼠表现出多饮、多尿、多食等糖尿病症状;空腹血糖明显升高,并呈持续状态;胰岛细胞明显稀疏;股骨组织学切片可见骨小梁稀疏;胫骨Micro-CT 扫描及三维重建显示大鼠骨体积分数及骨小梁数量显著降低,骨小梁分离度显著升高,出现明显骨质疏松影像。 说明,7 周龄雄性SD 大鼠在高糖高脂饲料喂养4 周基础上,联合采用小剂量STZ(35 mg/kg),可以成功建立T2DOP 大鼠模型。 造模后8 周从形态学、组织学、影像学等几方面可以确定DOP 模型的建立。

Guo 等[52]在研究葛根素是否通过HDAC1/HDAC3 信号通路抑制炎症和细胞凋亡减轻STZ 诱导的大鼠骨质疏松症时,选用体重180 ～ 190 g,7 ～8 周龄雄性SD 大鼠。 驯化1 周后,给予糖尿病组和葛根素治疗组大鼠喂饲高脂饮食(脂肪比45%)诱导胰岛素抵抗,共4 周。 4 周后,连续2 d 腹腔注射STZ 35 mg/kg 体重,建立2 型糖尿病模型。 注射STZ 后,大鼠接受溶剂对照组或葛根素治疗14 周。每周测量体重。 检测糖代谢及骨生成和骨吸收指标。 使用微型计算机断层扫描(μCT)评估左股骨或右股骨远端骨小梁结构,进行BMD 的测量。 结果显示STZ 处理的大鼠血糖、胰岛素水平增加,体重、BALP 和OPG 下降,TRACP-5b 和β-CTX 水平升高,BMD 下降,降低了骨体积/组织体积和骨小梁数量,上调了小梁分离度和结构模型指数,表明此法造模模型复制成功。

Yang 等[53]研究土贝母苷甲对2 型糖尿病诱导的骨丢失的影响时,选用体重(100±20)g 的4 周龄雄性无特异性病原体SD 大鼠,模型大鼠接受高糖高脂饮食(配方不明)5 周。 禁食12 h 后,大鼠腹腔注射35 mg/kg 的STZ。 一周后,当空腹血糖水平≥11.1 mmol/L 时,确认为糖尿病大鼠。 接下来给药6 周,治疗6 周后,收集其胫骨进行显微CT 分析、苏木精-伊红染色等,结果显示与正常组比较模型组大鼠骨体积/组织体积和骨小梁数量、骨小梁厚度降低,骨小梁分离度上升。

Ying 等[54]研究杨梅素对STZ 诱导的DOP 大鼠的骨保护作用,选用体重180 ～ 190 g 的雌性Wistar大鼠,适应性喂养1 周,模型组大鼠喂高糖高脂饲料(脂肪比45%)4 周,大鼠腹腔注射STZ 35 mg/kg 体重,连续2 d,建立2 型糖尿病模型。 72 h 后测定随机血糖,高于16.7 mmol/L 为糖尿病模型。 造模成功后,给予安慰剂对照或杨梅素治疗12 周。 每周检测静脉血糖,确保血糖水平在16.7 mmol/L 以上。给药12 周后,评估血清生化指标、股骨微结构和组织学变化。 结果显示糖尿病组大鼠体重下降,血糖升高,BMD 下降,血清ALP 和OC 明显降低,骨小梁体积分数、数目和厚度均低于对照组,结构模型指数和骨小梁间距均高于对照组。 苏木精-伊红染色显示股骨小梁断裂,数量减少。 Wang 等[55]在研究水飞蓟宾对STZ 所致大鼠DOP 的保护作用时采取了同样的造模办法,包括大鼠的品种、体重,高糖高脂饲料脂肪比、STZ 注射前喂养时间、STZ 的剂量、注射次数、成模标准、成模时间等均一样。

Lu 等[56]选用体重180 ～ 230 g 的雄性SD 大鼠,适应性喂养1 周,模型组高脂饲料(37% kcal 脂肪、46% kcal 碳水化合物、17% kcal 蛋白质和4.40 kcal/g 食物)喂养4 周后腹腔注射35 mg/kg 体重STZ 诱导T2DM。 STZ 注射72 h 后,禁食8 h,收集尾静脉血以测空腹血糖和空腹胰岛素。 口服灌胃50%葡萄糖水溶液后,进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。 空腹血糖超过11.1 mmol/L 为糖尿病模型造模成功。 8 周后,将大鼠的股骨、胫骨和血液收集供进一步分析。 结果显示,与正常组比较,糖尿病大鼠出现糖耐量异常、胰岛素抵抗,体重、BMD、BMC、OC 和骨ALP 显著降低,空腹血糖、TRACP-5b、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6 以及脂肪细胞和破骨细胞的数量上升/增多,骨体积/组织体积、骨小梁数量下降,小梁分离度和结构模型指数显著增加。 证明此法造模糖尿病大鼠出现骨代谢异常和严重的骨质流失。

柳辰玥[20]选用体重(180 ± 20)g 的Wistar 大鼠适应性喂养7 d 后,模型组予高糖高脂饲料(20%蔗糖,2.5%胆固醇,10%猪油,1%胆酸钠,66.5%基础词料)饲养。 10 周后,大鼠禁食不禁水12 h,模型组按20 mg/kg 体重腹腔注射1% STZ 柠檬酸缓冲液。注射STZ 7 d 后,尾静脉取血测空腹血糖,选血糖值≥ 12 mmol/L 且血清骨转换指标(IGF-1、TRAP)与正常对照组大鼠相比有显著统计学差异的大鼠作为DOP 模型大鼠。 12 周后,与对照组比较,模型组大鼠空腹血糖、AUC 升高,血清OC、IGF-1、OPG/RANKL 含量显著降低,ALP、TRAP 含量显著升高。Micro-CT 示大鼠皮质骨面积比、皮质骨厚度、骨小梁面积比显著降低。 股骨生物力学显示股骨的最大载荷、弹性模量和弯曲强度均显著降低。 苏木精-伊红染色示模型组大鼠股骨头部位骨小梁结构紊乱、变细、断裂、松散。 说明模型构建成功。

许建国等[21]、Zhang 等[57]在基于Wnt 及NF-kB信号通路研究补肾健脾活血汤对DOP 大鼠作用机制时选择体重210 ～ 260 g 的3 月龄SPF 级雄性Wistar 大鼠,适应性喂养1 周后,随机抽取10 只作为正常对照组,给予常规饲料饲养。 余45 只大鼠给予高糖高脂饲料(常规饲料中加入20%蔗糖、15%熟猪油、2.5%胆固醇、1.0%胆酸盐)喂养8 周,禁食不禁水12 h 后,左下腹腔给予STZ 30 mg/kg 注射。腹腔注射STZ 1 周后取尾血,以血糖值≥ 7.8 mmol/L 且伴有胰岛素抵抗为2 型糖尿病造模标准。 糖尿病大鼠成模后与正常对照组大鼠继续普通饮食喂养20 周,采用双能X 线骨密度仪对正常对照组及余符合2 型糖尿病诊断标准的大鼠股骨BMD 进行测定。 取骨密度小于正常对照组大鼠平均BMD2.5个标准差的作为T2DOP 模型大鼠。 成模12 周后采用血生化分析仪及双能X 线骨密度测量仪检测指标。 结果显示模型组大鼠空腹血糖、胰岛素、P、ALP水平升高、Ca 无差异,胰岛素抵抗增强,股骨近端BMD 下降。

综上,研究人员在选择高糖高脂饮食联合STZ建立T2DOP 模型时,高糖高脂饲料配方中脂肪比(40% ～ 60%)、组成中是否含有蔗糖、注射STZ 之前高糖高脂饲料的持续时间(4 ～ 10 周),STZ 的剂量、给药次数,糖尿病、糖尿病骨质疏松成模标准检测指标等存在差异,STZ 剂量多选用35 mg/kg,小剂量单次或者2 次,糖尿病成模标准主要看血糖、胰岛素水平,多饮多食多尿症状,通常多为注射STZ 后3 d 或7 d 空腹血糖≥ 11.1 mmol/L 或随机血糖≥16.7 mmol/L,成模后评价糖尿病骨质疏松模型的指标和方式有体重、血糖、胰岛素、OGTT 水平,骨生成(ALP、BALP、OC、OPG)和骨吸收(TRACP、β-CTX)耦联中的分子变化、骨密度、骨组织生物力学相关指标(最大载荷、弹性模量和弯曲强度)、股骨、胰腺组织病理形态、骨组织形态计量学参数(骨体积/组织体积、骨小梁数量、厚度、分离度、结构模指数)等。 发现与1 型糖尿病骨质疏松模型相比在造模过程中最大的区别为STZ 的给药剂量以及注射STZ之前是否喂食高糖高脂饲料。 具体见表1。

表1 通过链脲佐菌素诱导建立糖尿病骨质疏松大鼠模型的实验研究Table 1 Experimental study on establishment of diabetic osteoporosis rat model induced by streptozotocin

续表1

4 小结

以上实验性研究充分证实,STZ 诱导建立DOP大鼠模型的方法与大鼠的性别,年龄,是否喂食高糖高脂饲料以及高糖高脂饲料的配方、脂肪比、喂养时间,STZ 的品牌、纯度、储存配制方式、给药途径、给药剂量、给药次数、给药前是否禁食、禁食时间长短等众多因素密切相关,成模标准、检测指标多样,发病机制尚未完全阐明,国际上尚未有统一、系统、规范的制备DOP 模型的推荐剂量和标准。 因此,需要我们根据研究目的、实验要求,通过预实验来确定最佳条件,在实验过程中,严格要求,规范操作,避免人为因素影响实验结果。 此外,此种方法造模也存在骨组织病理改变、微结构损伤发生较慢,不能很准确的还原其病理过程和发病机制等局限,因此未来需要我们更加注重能够研究出模拟DOP 的发病机制和过程,协同多基因和环境因素的模型,更好的为DOP 的防治研究提供基础。

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