血管内皮细胞条件性敲除Cx43 杂合子小鼠模型建立及其血管功能变化的研究

彭小勇周远群张紫森邓蒙生雷艳李涛刘良明王建民康建毅杨光明*

(1.陆军军医大学大坪医院 野战外科研究部,战伤休克与输血研究室,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆 400042;2.陆军军医大学大坪医院 野战外科研究部, 武器杀伤生物效应评估研究室,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆 400042)

连接蛋白(connexin, Cx)属于一种跨膜蛋白,能在细胞膜上寡聚形成半通道,该通道是细胞间连接和交流的重要结构,并且具有调节环磷酸腺苷、钙离子以及三磷酸肌醇等小分子进出细胞的功能。根据其相对分子质量大小,连接蛋白命名为Cx26 ～Cx56[1-3]。 研究显示,连接蛋白在心血管系统中有大量表达并且发挥重要的作用,包括参与血管张力、血管生成以及心脏发育的调控等。 心血管系统表达的连接蛋白主要有Cx37、Cx40、Cx43 以及Cx45,其中,Cx43 在心血管系统中的作用受到广泛关注[4-5]。 为了深入研究Cx43 在哺乳动物中的作用,Reaume 等[6]首先利用基因编辑技术(先敲除胚胎干细胞中的Cx43,然后注射至C57 小鼠胚囊中)构建了Cx43 的杂合子敲除小鼠,随后Htet 等[7]用该小鼠证实了Cx43 在肺血管舒张反应性调节中发挥重要作用。 但是这种方法获得的是全身性广泛敲除Cx43 的小鼠模型,由于Cx43 在多个器官组织都有广泛分布且发挥不同的作用,这种广泛敲除模型用于对特定组织器官的研究中具有一定的局限性。 而目前有关血管特异性Cx43 敲除小鼠模型构建及其功能研究的报道尚少。 为此,本研究采用Cx43flox/flox小鼠、血管内皮细胞特异性表达Tie2-Cre重组酶小鼠以及C57BL/6 品系野生型小鼠,构建血管内皮细胞条件性敲除Cx43 杂合子小鼠(本研究未构建血管内皮细胞条件性敲除Cx43 纯合子小鼠的原因在于纯合子小鼠发育缓慢、出生后不久即死亡,我们在下文结果与讨论中进行了叙述),并通过PCR 鉴定基因组DNA、Western Blot 和免疫荧光染色检测血管Cx43 表达等方法进行验证,然后检测野生型和血管内皮细胞条件性敲除Cx43 杂合子小鼠肠系膜上动脉(superior mesenteric artery, SMA)的血管反应性(包括收缩和舒张反应性)。 希望为深入研究Cx43 在血管功能中的作用提供更合适的动物模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

8 只(雌雄各半)SPF 级Cx43flox/flox小鼠购自美国 Jackson 实验室( 动物检疫合格证号:1611A14822),2 只雄性SPF 级Tie2-Cre 重组酶小鼠购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司(原南京大学-南京生物医药研究院)【SCXK(苏)2020-0004】,C57BL/6 小鼠由陆军特色医学中心实验动物中心提供,均饲养于陆军特色医学中心实验动物中心SPF 级动物饲养环境【SYXK(军)2017-0026】,【SYXK(军)2017-0058】,饲养期间自由饮水饮食。 饲养环境:昼夜各半循环照明,湿度恒定(40%～70%),温度控制在22 ～ 24℃ 。 所有操作均符合陆军军医大学实验动物福利伦理审查委员会要求(AMUWEC2020034)。 野生型和Cx43 敲除杂合子小鼠各10 只,8～12 周龄,体重20 ～25 g,实验时用0.03% 的戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔麻醉,处死后取血管进行后续实验。

1.1.2 主要试剂与仪器

鼠尾检测试剂盒(包括DNA 提取试剂和PCR试剂) 购 自 美 国Bimake 公 司;克-亨 氏(Krebs-Henseleit ,K-H)液自配,配制所需药品均购自生工生物工程(上海)股份有限公司,去甲肾上腺素购自远大医药(中国)有限公司,乙酰胆碱购自生工生物工程(上海) 股份有限公司;蛋白提取液(RIPA)购自美国MCE 公司,Cx43 一抗购自美国Sigma 公司,山羊抗兔和抗小鼠荧光二抗购自美国Jackson Immuno Research 公司,磷酸盐缓冲液(PBS)粉剂购自中杉金桥生物技术有限公司,免疫荧光二抗购自美国CST 公司,DAPI 购自英国abcam 公司。

PCR 仪(Bio-Rad,美国),双色红外成像激光系统(LI-COR,美国),石蜡切片机(Leica,德国),激光共聚焦显微镜(Leica,德国),微血管张力测定仪(AD Instrument,澳大利亚)。

1.2 方法

1.2.1 敲基因小鼠模型构建

Cx43flox/flox小鼠遗传背景转换:将2 只雌性Cx43flox/flox小鼠与1 只雄性C57BL/6 小鼠合笼饲养,得到F1 子代小鼠,然后对所有子代小鼠基因型进行鉴定,选出基因型为Cx43flox/+的F1 小鼠作为亲本,待其性成熟后按雌∶雄= 2 ∶1的比例继续与新的C57BL/6 小鼠合笼进行回交,得到F2 子代小鼠,选出基因型为Cx43flox/+的子代作为亲本进行回交,依次回交9 次。 选择基因型为Cx43flox/+的F10 不同性别小鼠进行互交,再选择基因型为Cx43flox/+或者Cx43flox/flox与 Cre 小鼠交配可获得 Tie2-Cre/Cx43flox/+小鼠[8]。

1.2.2 基因型鉴定

小鼠出生后2～3 周进行编号,并取2 mm 长的鼠尾鉴定。 将鼠尾放入1.5 mL EP 管中按照试剂盒说明书按比例加入DNA 提取液,放入55℃水浴锅中30 min,然后95℃干浴10 min 待用。 Flox 引物:上游引物序列5’-CTTTGACTCTGATTACAGAGC TTAA-3’,下游引物序列5’-GTCTCACTGTTACTT AACAGCTTGA-3’;Tie2-Cre 引物:上游引物序列5’-GCCTGCATTACCGGTCGATGC-3’,下游引物序列5’-CAGGGTGTTATAAGCAATCCC-3’。 反应体系均为20 μL: 2 × M-PCR Mix 10 μL, 上 游 引 物(10 μmol/L)1 μL, 下游引物(10 μmol/L)1 μL,无酶水6 μL,模板DNA 2 μL。 反应条件按照购买实验室提供的程序设置,Flox:94℃ 2 min;(94℃ 20 s,65℃ 15 s,每个循环降0.5℃,68℃ 10 s)×10 循环;(94℃ 15 s,60℃ 15 s,72℃ 10 s)×28 循环,72℃ 2 min。 Cre:95℃ 5 min;(95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃45 s)×30 循环;72℃ 5 min。 扩增结束后用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳(上样量为10 μL),根据电泳结果来鉴定小鼠基因型。

1.2.3 Western Blot 法检测Cx43 蛋白在SMA 中表达

取小鼠SMA 放入匀浆器中,加入预冷的含蛋白酶抑制剂RIPA,研磨后在冰上裂解30 min 后离心(12 000 r/min,15 min,4℃),取上清后加上样缓冲液,100℃干浴5 min 使蛋白变性;然后制备10%SDS-PAGE 分离胶,上样量每孔为30 μg。 Cx43(1 ∶5000)和β-actin(1 ∶7000)使用一抗稀释液进行稀释,二抗为山羊抗兔和抗小鼠(1 ∶10000)。 用双色红外成像激光系统扫描,获得Cx43 的蛋白表达图像。 用Quantity One 分析软件读取各组荧光值,并以β-actin 作为内参计算相对表达量[9]。 对来源于不同个体的野生型和小鼠的血管组织样本进行检测,实验重复3 次,对各组相对表达量进行统计学分析。

1.2.4 免疫荧光法检测Cx43 蛋白在SMA 中表达

快速取小鼠SMA 放入冰的4%多聚甲醛固定24 h,然后用梯度浓度乙醇脱水,经石蜡包埋后切片,再经脱蜡、水化及抗原修复;用0.3% TritonX-100 破膜3 min, 加 0.1%牛血清白蛋白室温封闭2 h,然后孵育Cx43 一抗(1 ∶500)过夜;次日加二抗(Alexa Fluor 488,1 ∶200)37℃孵育2 h,DAPI 染核后再加抗淬灭封片剂封片,最后用共聚焦显微镜观察[10]。

1.2.5 小鼠SMA 血管舒张/收缩功能检测

取小鼠SMA 制备血管环,并将其挂于盛有K-H液的恒温器官灌流槽。 每30 min 更换1 次K-H 液,更换4 次后加入高钾溶液诱导血管预收缩,待收缩达到平台期后再换K-H 液稳定30 min,然后向恒温槽中依次加入去甲肾上腺素(NE,终浓度为10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L),待收缩达到平台期后向恒温槽中依次加入乙酰胆碱(ACh,终浓度为10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)。 读取加高钾溶液前的基础张力值为T1、高钾液刺激后血管环收缩达到平台期的张力值为T2,加NE 前的基础张力值为T1’、加NE 后血管环收缩达到平台期的张力值为T2’、加ACh 后血管环舒张达到平台期的张力值为T3,分别采用最大收缩张力和舒张率来反映收缩和舒张反应性,血管收缩反应性=(T2’- T1’)/(T2-T1)×100%;血管舒张反应性=(T2’- T3)/(T2’-T1’)×100%[11-12]。

1.3 统计学分析

用SPSS 18.0 统计软件进行统计分析,实验数据以平均值±标准差(±s)表示,采用t检验比较两组之间的差异。 以P＜ 0.05 表示差异具有显著性。

2 结果

2.1 小鼠基因型鉴定

基因组中Flox 纯合电泳结果为580 bp 条带,杂合则为580 bp 和490 bp 双条带,野生型则为490 bp条带;Tie2-Cre 阳性电泳结果为481 bp,阴性则无条带[13]。 图1A 中编号1 ～6 是同窝小鼠,1、2、3、4 号是Tie2-Cre 阳性小鼠;2、3、5、6 号是Cx43flox/flox小鼠。 综 合 结 果 表 明, 2 号 和3 号 是 Tie2-Cre/Cx43flox/flox小鼠。 图1B 中编号7 ～12 是同窝小鼠:11 和12 号是Tie2-Cre 阳性小鼠;8 和11 号是Cx43flox/+小鼠。 综合结果表明,11 号是Tie2-Cre/Cx43flox/+小鼠。 后续实验以同样的鉴定筛选方式,由于Tie2-Cre/Cx43flox/flox纯合子小鼠发育缓慢、出生后不久即死亡,选取同窝中的野生型和杂合子敲除型小鼠进行后续实验。

图1 小鼠基因型的鉴定结果Note. M. Marker (biomed, BM2000 or BM2000+). A. Identification of the genotype of Tie2-Cre/Cx43flox/flox mice (1 ～6. The number of mice littermates, 2 and 3 are Tie2-Cre/Cx43flox/floxmice). B. Identification of the genotype of Tie2-Cre/Cx43flox/+mice (7 ～12. The number of mice littermates, 11 is a Tie2-Cre/Cx43flox/+mouse).Figure 1 Identification of the genotype of offspring mice

2.2 血管内皮Cx43 敲除小鼠蛋白表达验证

图2A 中Western Blot 结果显示,Cx43 敲除杂合子小鼠SMA 中Cx43 蛋白表达水平明显降低,与野生型小鼠比较差异有显著性(P＜ 0.01)。 图2B,2C中免疫荧光结果显示,野生型小鼠SMA 管腔内皮面Cx43 连续表达,而Cx43 敲除杂合子小鼠SMA 管腔内皮面Cx43 表达降低,连续性变差并出现断裂和缺失,与野生型小鼠比较明显降低。

图2 验证Cx43 敲除杂合子小鼠SMA 中Cx43 的表达情况(n=3)Note. M. Marker (Thermo scientific, 26616). WT. Wild type mice. KO. Heterozygous Cx43 knockout mice. A. Expression of Cx43 in SMA detected by Western Blot. B. Statistical plot of fluorescent ratio. Compared with WT group,**P ＜ 0.01. C. Expression of Cx43 in SMA detected by IF.Figure 2 Verification of Cx43 in SMA in heterozygous Cx43 knockout mice(n=3)

2.3 敲除Cx43 后对小鼠SMA 血管舒张/收缩功能的影响

图3A 为野生型和Cx43 敲除杂合子小鼠SMA的代表性收缩/舒张曲线,图3B 的血管收缩功能检测的统计结果显示,血管内皮细胞条件性敲除Cx43杂合子小鼠SMA 对NE 诱导的收缩反应性与野生型小鼠相比无明显差异。 而图3C 的血管舒张功能检测的统计结果显示,Cx43 敲除杂合子小鼠SMA对ACh 诱导的内皮依赖性的舒张反应性显著降低(P＜ 0.01),仅为野生型小鼠10%左右。

图3 敲除Cx43 后对小鼠SMA 血管舒张/收缩功能的影响(n = 8)Note. WT. Wild type mice. KO. Heterozygous Cx43 knockout mice. A. Representative curve of vascular relaxation/constriction. B. Statistical plot of contractile response. C. Statistical plot of relaxation reactivity. Compared with WT group,**P ＜ 0.01.Figure 3 Effect of Cx43 knockout on the vascular relaxation/constriction of SMA(n = 8)

3 讨论

近年来国内外研究表明,血管中连接蛋白43(Cx43)的表达变化及其构成的缝隙连接通道与多种血管疾病(如高血压、动脉粥样硬化等)的发生发展密切相关[14-16],但是其具体作用机制仍不十分清楚。 血管平滑肌细胞和内皮细胞是构成血管的主要细胞,它们之间的相互调节是血管病理生理研究的重要内容。 因此,构建血管平滑肌细胞或内皮细胞特异性敲除Cx43 的动物模型对深入研究Cx43 在血管功能中的作用机制具有重要意义。 血管反应性(包括收缩和舒张反应性)是指在生理或病理条件下,器官毛细血管或中小动脉通过收缩或舒张调节器官血流量,以维持器官血流稳定、适应器官功能变化的能力,是反映血管舒缩功能以及血管储备功能的重要指标[17-18]。 血管平滑肌细胞或内皮细胞之间的缝隙连接通道所传导的信号能协调血管的收缩和舒张[19]。

连接蛋白(connexin, Cx)属于高度保守的膜蛋白,可通过形成缝隙连接通道参与细胞内外及细胞间的物质信息交流(包括直接的电和化学交流等),进而调节细胞的增殖、分化及凋亡等多种病理生理反应[20]。 有研究显示,在哺乳动物中发现的连接蛋白有21 种,心血管系统中表达的连接蛋白主要有Cx43、Cx40、Cx37 以及Cx45,其中,Cx43 因其在心血管系统中的重要作用而受到关注,它在血管平滑肌细胞与血管内皮细胞中都有分布[19]。 既往对广泛性敲除Cx43 的杂合子小鼠的研究显示,乙酰胆碱诱导的肺血管舒张反应性与野生型小鼠比较明显降低[7]。

Cre-loxP 重组系统目前是敲除效率相对较高、应用较广的一种位点特异性的条件性基因打靶系统。 该系统是通过两类小鼠来获得条件性基因敲除小鼠模型,一类是基因锚定的flox 小鼠(各种目的基因同源重组引入loxP 位点),另一类是Cre 重组酶转基因小鼠(各种组织/细胞特异性或可诱导调控表达Cre 重组酶)[21]。 本研究将Cx43flox/flox小鼠与血管内皮细胞特异性表达Tie2-Cre 重组酶小鼠进行交配,先通过基因组DNA 鉴定,筛选出血管内皮细胞Cx43 敲除的杂合子小鼠,然后进一步验证Cx43 在血管中的蛋白表达,并初步探讨了特异性敲除Cx43 对血管舒缩功能的影响。 研究结果显示,血管内皮细胞条件性敲除Cx43 杂合子小鼠肠系膜上动脉中Cx43 蛋白表达水平与野生型小鼠比较明显降低,其舒张反应性与野生型小鼠比较显著降低。本研究在早期实验中拟建立血管内皮特异性敲除Cx43 的纯合子小鼠模型,但在实验过程中发现,虽然能够繁殖获得Tie2-Cre/Cx43flox/flox纯合子小鼠,但其发育缓慢、体型与体重均明显不如同阶段其他基因型小鼠,并且均在4～5 周内死亡。 我们推测其可能原因在于Cx43 在多种脏器(尤其是大脑与心血管系统)的发育与功能调节中起重要作用[22],尽管我们采用了血管特异性的Cre 小鼠进行杂交,但由于不是诱导型的Cre 小鼠,仍然可能出现Cx43 纯合子小鼠发生重要器官的发育畸形和功能异常的情况,这就导致纯合子小鼠在胚胎期或者出生后不久就会死亡。 我们下一步拟采用诱导型的Tie2-Cre小鼠进行繁殖,以获得血管特异性敲除Cx43 的纯合子小鼠模型。 此外,基因组测序在研究中越来越受到人们的关注,具有高分辨率、结果精确等优点。我们拟在下一步研究中进一步完善对Tie2-Cre/Cx43flox/+杂合子小鼠和其他基因型小鼠的测序检测实验,以更精确证明小鼠模型结果的正确性。

综上所述,本研究完成了血管内皮细胞条件性敲除Cx43 杂合子小鼠的构建并进行鉴定,对Cx43敲除的杂合子小鼠血管功能的研究也证实了Cx43在血管功能调节中的重要作用,尤其是对血管内皮依赖性的舒张功能的调节作用,可为深入研究Cx43在血管功能调节中的作用与机制提供较好的动物模型。

参考文献(References)

[ 1] Martin PE, Evans WH. Incorporation of connexins into plasma membranes and gap junctions [J]. Cardiovasc Res, 2004, 62(2): 378-387.

[ 2] Figueroa XF, Duling BR. Gap junctions in the control of vascular function [J]. Antioxid Redox Signal, 2009, 11(2): 251-266.

[ 3] Morel S. Multiple roles of connexins in atherosclerosis-and restenosis-induced vascular remodelling [J]. J Vasc Res, 2014,51(2): 149-161.

[ 4] Johnstone S, Isakson B, Locke D. Biological and biophysical properties of vascular connexin channels [J]. Int Rev Cell Mol Biol, 2009, 278(3): 69-118.

[ 5] Simon AM, Goodenough DA. Diverse functions of vertebrate gap junctions [J]. Trends Cell Biol, 1998, 8(12): 477-483.

[ 6] Reaume AG, de Sousa PA, Kulkarni S, et al. Cardiac malformation in neonatal mice lacking connexin43 [J]. Science 1995, 267(5205): 1831-1834.

[ 7] Htet M, Nally JE, Shaw A, et al. Connexin 43 plays a role in pulmonary vascular reactivity in mice [J]. Int J Mol Sci, 2018,19(7): 1891-1911.

[ 8] 吴玲玲, 朱晗玉, 洪权, 等. Mxi1 基因敲除小鼠遗传背景的转换研究 [J]. 军事医学, 2016, 40(6): 488-490, 511.Wu LL, Zhu HY, Hong Q, et al. Genetic background transformation in Mxi1 gene knockout mice [J]. Mil Med Sci,2016, 40(6): 488-490, 511.

[ 9] 龚姗, 李弘, 刘叶倩, 等. 复方七芍降压片对TNF-α 诱导的与平滑肌细胞共培养的血管内皮细胞中炎症因子与AP-1、MCP-1 蛋白表达的影响 [J]. 中国实验动物学报, 2020, 28(6): 733-741.Gong S, Li H, Liu YQ, et al. Effects of compound Qishao Jiangya tablet on inflammatory factor, AP-1 and MCP-1 in vascular endothelial cells stimulated with TNF-α and co-cultured with smooth muscle cells [J]. Acta Lab Anim Sci Sin, 2020, 28(6): 733-741.

[10] Zheng D, Zhang J, Zhang Z, et al. Endothelial microvesicles induce pulmonary vascular leakage and lung injury during Sepsis[J]. Front Cell Dev Biol, 2020, 8: 643.

[11] 彭小勇, 周海军, 李涛, 等. 钙敏感性受体抑制剂Calhex231对创伤失血性休克大鼠的保护作用 [J]. 中华创伤杂志,2018, 34(6): 555-561.Peng XY, Zhou HJ, Li T, et al. Protective effect of calciumsensing receptor inhibitor Calhex231 Oil traumatic hemorrhagic shock rats [J]. Chin J Trauma, 2018, 34(6): 555-561.

[12] 彭小勇, 李涛, 刘良明, 等. CaSR 在大鼠血管收缩/舒张反应性调节中的作用 [J]. 局解手术学杂志, 2016, 25(9):629-632.Peng XY, Li T, Liu LM, et al. Effects of CaSR on vascular relaxation /constriction in rats [J]. J Reg Anat Oper Surg,2016, 25(9): 629-632.

[13] 黄艺滢, 张文龙, 石桂英, 等. 细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)敲除和人源化小鼠模型的建立 [J]. 中国实验动物学报, 2021, 29(3): 307-315.Huang YY, Zhang WL, Shi GY, et al. Establishment of CTLA4-knockout mice and CTLA4-humanized mice [J]. Acta Lab Anim Sci Sin, 2021, 29(3): 307-315.

[14] 吴立晗, 巫相宏, 闭奇, 等. PPAR-γ 激动剂干预TLR4/PI3K通路对脂多糖诱导人冠状动脉血管内皮细胞Cx43 表达的影响 [J]. 广西医科大学学报, 2021, 38(6): 1124-1128.Wu LH, Wu XH, Bi Q, et al. Effect of PPAR-γ agonist on Cx43 expression in LPS-induced human coronary artery endothelial cells by regulating TLR4/PI3K pathway [J]. J Guangxi Med Univ, 2021, 38(6): 1124-1128.

[15] 汪小英, 余艳荣, 王美玲, 等. 吴茱萸次碱抑制AngⅡ诱导的血管平滑肌Cx43 表达上调 [J]. 中国药理学通报, 2018,34(8): 1139-1145.Wang XY, Yu YR, Wang ML, et al. Rutaecarpine prevents upregulation of Cx43 in vascular smooth muscle cells induced by angiotension Ⅱ [J]. Chin Pharmacol Bull, 2018, 34(8): 1139-1145.

[16] 吴亚辉, 乔梁, 林洪启. 基于Cx43/mito-KATP 信号轴观察右美托咪定预处理对大鼠离体缺血再灌注心脏的保护机制[J].中国比较医学杂志, 2021, 31(10):76-84.Wu YH, Qiao L, Lin HQ. The protective mechanism of dexmedetomidine preconditioning on ischemia-reperfusion of the isolated rat heart uses the connexin43/mito-KATP signaling axis[J]. Chin J Comp Med, 2021, 31(10): 76-84.

[17] Wszedybyl-Winklewska M, Wolf J, Szarmach A, et al. Central sympathetic nervous system reinforcement in obstructive sleep apnoea [J]. Sleep Med Rev, 2018, 39(3): 143-154.

[18] Bhogal AA, Philippens ME, Siero JC, et al. Examining the regional and cerebral depth-dependent BOLD cerebrovascular reactivity response at 7T [J]. Neuroimage, 2015, 114(8): 239-248.

[19] 于学军, 何作云. 缝隙连接在血管内皮细胞和平滑肌细胞间信号传递的研究进展 [J]. 重庆医学, 2010, 39(11): 1448-1450.Yu XJ, He ZY. Research of gap junction in signal transmission between vascular endothelial cells and smooth muscle cells [J].Chongqing Med, 2010, 39(11): 1448-1450.

[20] 付艳琪, 伍宇思, 罗丹. Cx43 在血管平滑肌及血管重构中的研究进展 [J]. 重庆医科大学学报, 2016, 41(12): 1254-1257.Fu YQ, Wu YS, Luo D. Research of Cx43 in vascular smooth muscle and vascular remodeling [J]. J Chongqing Med Univ,2016, 41(12): 1254-1257.

[21] Ling YH, Ma JX, Qi XL, et al. Novel rat model of multiple mitochondrial dysfunction syndromes (MMDS) complicated with cardiomyopathy [J]. Anim Mod Exp Med, 2021, 4(4): 381-390.

[22] 李行, 景雅, 李云华, 等. Cx43 敲除小鼠胚胎心脏流出道内第二生心区和心脏神经嵴来源间充质细胞减少 [J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2018-2024.Li H, Jing Y, Li YH, et al. A downtrend of mesenchymal cells derived from the second heart field and cardiac neural crest in the outflow tract of Cx43 knockout embryonic mouse heart [J]. Chin J Tissue Eng Res, 2021, 25(13): 2018-2024.