取卵后立即冻胚移植患者血清E2、P、VEGF水平与妊娠结局的相关性

张秀芬 赵建峰

新鲜胚胎移植后未孕以及全胚冷冻的患者，为了让机体功能得以恢复，通常建议患者取卵后2～3个月以后行首次冻融胚胎移植，延迟移植时间可能会增加不孕夫妇的压力及焦虑。冻融胚胎移植(frozen thawed embryo transfer,FET)作为不孕症的有效治疗手段，可以预防卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome,OHSS)，减少超促排卵及取卵的创伤，增加周期累计妊娠率，不仅减少了患者的经济支出，而且提高了辅助生殖技术治疗的安全性。FET前需要一定的方案准备子宫内膜，临床上采用较多的FET子宫内膜准备方案是自然周期和激素替代周期。正常自然月经周期受孕，胚胎着床一般开始于月经第19天，持续4～5 d，即月经第19～24天，适合胚胎着床，临床上称为“种植窗”(window of implantation，WOI)[1]；雌激素促使子宫内膜上皮细胞和腺体增生，孕激素受体的合成也需要适量的雌激素，在此基础上，孕激素促进内膜上皮细胞分泌糖原等营养物质，间质蜕膜样变，子宫内膜血流进一步丰富，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是主要的血管生成因子，可以促进子宫内膜及其血管的生长，多种因子共同调节子宫内膜容受状态，为胚胎着床和早期胚胎发育提供必需的物质基础，开启“种植窗”。基于临床工作的需求，探讨取卵后1～2个月行首次FET，不同子宫内膜准备方案妊是否和娠结局相关，在FET过程中，监测血清雌二醇(estradiol，E2)、孕酮(progesterone，P)及VEGF水平能否预测妊娠的结局。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取沧州市人民医院生殖科2020年1～12月接受体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗的不孕症患者，获本院医学伦理委员会批准。

1.2 标准

1.2.1 诊断标准：未避孕、有正常性生活至少12个月而未孕，称为不孕症。

1.2.2 入组标准: ①年龄20～40岁；②冻存至少1枚优质胚胎，D3卵裂期优质胚胎,卵裂球数6～9个，胞质均匀，形态规则，碎片<10%,优质囊胚评分≥3BB；③IVF-ET治疗指征为输卵管因素或男性因素；④采用拮抗剂方案或者卵泡期长方案促排卵；⑤取卵后第一次FET。

1.2.3 排除标准： ①子宫畸形、子宫内膜异位症、宫腔粘连；②合并免疫性疾病；③反复种植失败者；④年龄>40岁。

1.3 方法

1.3.1 对应取卵周期超促排卵方案

1.3.1.1 拮抗剂方案：于患者月经第1～3天检测验血性激素水平，行阴道B超检查，评估一般情况及卵巢功能，予促性腺激素(Gn)100～300 U启动，每2～5天根据阴道B超测量卵泡径线及血清性激素水平变化调整Gn剂量。优势卵泡直径>12 mm和血清(E2)>300 ng/L时起(或者在使用Gn第6天起)[2]，加用促性腺激素释放激素拮抗剂(GnRH-ant) 0.25 mg/d，至扳机日，当≥2个卵泡的平均直径≥18 mm时，给予促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)0.2 mg、人绒毛膜促性腺激素(HCG)6 000～10 000 U扳机，促进卵泡进一步发育成熟，间隔36 h行阴道B超引导下穿刺取卵，当日行IVF/ICSI。

1.3.1.2 卵泡期长方案：于月经第1～3天给予长效促性腺激素释放激素类似物(GnRH-a)进行垂体降调节，需28～39 d，达到降调节标准[3](FSH<5 U/L、LH<5 U/L)、子宫内膜<5 mm、卵泡直径≤5 mm、血清E2<183.5 pmol/L后给予Gn 150～300 U启动，每2～5天根据阴道B超测量卵泡径线及血性激素水平变化调整Gn剂量。当有≥2个卵泡的平均直径≥18 mm时，使用HCG 6 000～10 000 U扳机，促进卵泡进一步发育成熟，间隔36 h行阴道B超引导下穿刺取卵，当日行IVF/ICSI。

1.3.2 根据准备子宫内膜周期方案分组：共纳入首次解冻移植病例174例，其中135个周期为新鲜周期未移植，因预防OHSS或者子宫内膜容受性差等原因行全胚冷冻,其余39个周期为鲜胚移植后未孕或流产。自然周期(A组)54例，平均年龄(31.09±3.52)岁；激素替代周期(B组)64例，平均年龄(31.15±4.15)岁；晚刺激周期(C组)56例，平均年龄(30.14±4.59)岁。月经第1～3天行基础内分泌检测，阴道B超检查排除子宫及卵巢异常情况。

1.3.3 胚胎来源及解冻

1.3.3.1 对应卵巢刺激方案 主要包括卵泡期长方案、拮抗剂方案，IVF-ET均按本中心常规进行。取卵后第3天(卵裂期胚胎) 或第 5～6天(囊胚)达到冷冻标准的胚胎进行冻存。

1.3.3.2 胚胎分级解冻 卵裂期胚胎分级标准为：Ⅰ级胚胎为卵裂球大小均匀，无或仅有极少(<10%)碎片；Ⅱ级胚胎为卵裂球大小稍不均匀，碎片率10%～20%；Ⅲ级胚胎：卵裂球大小明显不均匀，碎片率21%～50%；Ⅳ级胚胎：卵裂球大小很不均匀，碎片率≥50%。采用玻璃化冷冻和解冻程序(均采用日本加藤公司解冻试剂)。

1.3.4 子宫内膜准备方案

1.3.4.1 A组：月经第10～12日有卵泡自然生长，必要时检测血LH、E2、P[4]，监测到卵泡发育成熟并排卵，排卵后给予黄体酮20 mg，肌内注射，1次/d。排卵后第3天移植卵裂期胚胎。移植后黄体支持，给予黄体酮20 mg，肌内注射，1次/d；地屈孕酮10 mg，口服，2次/d。

1.3.4.2 B组：月经周期第3天起口服戊酸雌二醇片4 mg/d，B超监测子宫内膜，根据内膜生长情况调整激素用量(口服戊酸雌二醇最多加至9 mg/d；口服芬吗通红片最多加至8 mg/d)，雌激素补充至少12 d，若子宫内膜厚度仍<6 mm，加用芬吗通白片(内含雌二醇 1 mg/片)1～2 mg，(1次/d)，阴道给药至内膜转化日。内膜厚度≥8 mm时，加用肌内注射黄体酮60 mg，(1次/d)；在给黄体酮第4天行冻融胚胎移植，移植后加用地屈孕酮10 mg，口服，3次/d，并继续予戊酸雌二醇口服和黄体酮肌内注射。

1.3.4.3 C组：月经第10～12日[5]阴道B超未观测到优势卵泡生长，给予尿促性素75～150 U,肌内注射,1次/d，促使卵泡生长发育，必要时检测血LH、E2、P，监测到卵泡发育成熟并排卵，移植时间及移植后黄体支持同自然周期。

1.4 妊娠结局的判断标准 (1)生化妊娠：胚胎移植后12～14 d化验血清β-HCG≥25 U/ml，阴道超声未见孕囊前HCG值逐渐下降提示生化妊娠；(2)临床妊娠：胚胎移植4周后通过阴道B超检查观察到孕囊及原始心血管搏动；(3)异位妊娠：移植后30～35 d通过阴道B超检查宫腔内未探及孕囊，附件区探及孕囊或包块回声为异位妊娠;(4)早期流产：孕12周前流产诊断为早期流产；(5)活产：有胎儿活产(包括早产)者为活产周期。

1.5 观察指标及妊娠结局判断[6]:在子宫内膜转化前(A组、C组均于排卵日，B组于P给药前)和胚胎移植前一天检测血清E2、P以及VEGF水平；胚胎移植后12～14 d根据血β-hCG值确定为生化妊娠，是否临床妊娠需移植后4周根据超声检查确定。临床妊娠率=移植后临床妊娠患者数/冻融胚胎移植患者数×100%，着床率=超声可见孕囊数/总移植胚胎数×100%，异位妊娠率=移植后异位妊娠患者数/临床妊娠患者数×100%；早期流产率=移植后自然流产患者数(<妊娠12周)/临床妊娠患者数×100%；活产率=活产周期数/移植周期数×100%。分组计算以上指标，并将数据进行比较。

2 结果

2.1 患者进入周期前一般情况及FSH、LH、E2比较 3组年龄、体重指数(BMI)、不孕年限、卵巢基础状态等均符合正态分布，组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 3组患者一般情况及基础性激素水平比较

2.2 3组子宫内膜转化日子宫内膜比较 A组子宫内膜厚度为9.5(8.68，11.33)mm，38例为A型内膜，16例为B型内膜；B组子宫内膜厚度为9.15(8.50，9.70)mm,45例为A型内膜,19例为B型内膜；C组子宫内膜厚度为9.35(8.83，11.78)mm,43例为A型内膜,13例为B型内膜；子宫内膜厚度在A组和B组(P=0.026)、C组和B组(P=0.016)比较均有差异， A组和C组子宫内膜厚度比较差异无统计学意义(P=0.645)。

2.3 3组子宫内膜转化前后血E2、P、VEGF水平比较

2.3.1 子宫内膜转化前:血E2值A组和C组(P=0.000)B组和C组(P=0.000)比较有差异，A组和B组比较无差异(P=0.387)；血清P值A组和B组(P=0.000)，A组和C组(P=0.001)，B组和C组(P=0.000)比较差异均有统计学意义；3组间血VEGF水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3.2 子宫内膜转化后:血E2水平A组和B组有差异(P=0.001)，B组和C组间(P=0.156)、A组和C组间(P=0.052)无差异；血P和VEGF水平3组间比较无差异(P>0.05)。见表2。

表2 3组子宫内膜转化前后血E2、P、VEGF水平比较

2.4 妊娠者和未妊娠者子宫内膜转化前后血清E2、P、VEGF比较 将174例患者按是否临床妊娠分为妊娠者(n=97)和未妊娠者(n=77)2组，子宫内膜转化前后E2、P、VEGF水平差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 妊娠者和未妊娠者血清E2、P、VEGF比较

2.5 FET后临床妊娠率、着床率、早期流产率、异位妊娠率及活产率比较 3组患者的临床妊娠率、着床率、活产率及异位妊娠率差异均无统计学意义(P>0.05)。B组患者的早期流产率较高，与A组比较差异无统计学意义(P=0.172)；B与C组比较差异有统计学意义(P=0.028)，A组与C组间无差异(P=0.368)。见表4。

表4 3组患者妊娠结局的比较 %(例)

3 讨论

3.1 不同内膜准备方案对子宫内膜厚度的影响 有研究显示：相比于激素替代周期，自然周期内膜厚度较高[7，8]；另有研究则认为：降调节+激素替代周期子宫内膜厚度更高[9，10]。我们的数据显示子宫内膜厚度自然周期和晚刺激周期均高于HRT周期，可能因为自然周期和晚刺激周期均为长卵周期，尤其晚刺激方案在卵泡自然生长的基础上加用一些药物刺激卵泡生长，内膜转化前E2水平较高，而且在卵泡生长过程中除了雌、孕激素可能还会产生其他因子，辅助刺激了子宫内膜的增长及转化，更有利于增加子宫内膜的厚度。对于以往内膜偏薄的患者可考虑根据情况采用自然周期或者晚刺激周期准备内膜。关于FET周期的一项研究显示，子宫内膜厚度<6 mm与活产率显著降低明显相关，在7～10 mm后活产率趋于稳定[11], Shaodi等[12]认为在HRT-FET周期中，当子宫内膜厚度保持在8.7～14.5 mm时，可获得最佳活产率。

3.2 子宫内膜准备方案与妊娠结局 一项分析表明各种子宫内膜准备方案的妊娠率无显著差异[13]；关于妊娠结局的报道各异，有研究认为改良自然周期具有更高的活产率[14]；Peigné 等[15]研究认为促排卵周期比激素替代周期有更高的活产率；一项多中心的试验表明：自然周期以及激素替代周期方案准备内膜活产率、持续妊娠率等结局方面并没有差异[16]； Yarali等[17]的研究表明：自然周期临床妊娠率高于没有降调的激素替代周期，但活产率没有差别，而降调节后激素替代周期活产率高于自然周期，没有发现一种内膜准备方案，保持始终如一的优势。以上研究结果并没有特意提到FET是发生在取卵后多长时间，我们的研究是在取卵后第1～2个月即行FET, 结果是自然周期、激素替代周期、晚刺激周期3种内膜准备方案临床妊娠率无差异；激素替代周期和自然周期比较早期流产率无差别；数据表明：激素替代周期的早期流产率高于晚刺激周期，晚刺激周期使用HMG刺激卵泡生长的过程中或许产生的物质对于黄体的发育起了作用，更利于维持继续妊娠。对于以前激素替代周期内膜反应不良的患者采用HMG治疗，董曦等[18]研究表明：临床妊娠率HMG组显著高于HRT组,而流产率HMG组显著低于HRT组。晚刺激方案相比于促排卵周期，不易发生卵巢过度刺激，相比于激素替代周期子宫内膜厚度平均值较高，晚刺激方案的应用也减少了自然周期卵泡不能生长的机会，降低自然周期取消率。

3.3 子宫内膜转化前后E2、P、VEGF水平的变化

3.3.1 FET前E2水平：有研究发现： HRT-FET周期E2值(100～500 pg/ml)妊娠率相似,当E2水平<100 pg/ml或>500 pg/ml时，流产率显著增加，过高或过低的雌激素水平可能都会影响胚胎种植[19]。Zhou等[20]的研究认为P给药前血清E2水平升高与冻融囊胚移植后活产率降低有关；另外有研究认为HRT-FET周期内膜转化前血清高E2水平不影响妊娠结局[21]，冷冻胚胎移植周期的持续妊娠率不受E2水平升高的负面影响。我们的结果分析：3组患者在子宫内膜转化前E2值有差异，转化后血清E2水平在HRT周期最高，但是3组的临床妊娠率无差异，妊娠者和未妊娠者内膜转化前后E2水平并无差异，更是证明了E2并不是剂量依赖的，更可能是起允许作用，水平高低并不能影响临床妊娠率。

3.3.2 FET前P水平:尽管P监测通常不在常规临床实践中进行，有研究数据显示血清P浓度与活产率亦相关，胚胎移植日平均血清P为11.4 ng/ml，血清P<10 ng/ml，妊娠率显著降低(P=0.04)，活产率降低(P=0.01)[22]。另有研究认为：FET当天的血清P水平≥10 ng/ml，不会显著改善妊娠结局，P<5 ng/mg与低活产率相关，表明P存在一个阈值，低于该阈值很难挽救FET周期妊娠结局[23]。我们的数据内膜转化前P水平在晚刺激周期最高，进一步分析内膜转化前后血清P水平在妊娠者和未妊娠者之间并没有差别，可能内膜转化后黄体支持比较充分，P水平普遍较高，恰都在阈值之上，高水平的P对妊娠率及妊娠结局就已不具有预测作用，因此对于充分黄体支持的患者，没有必要监测血清P水平。

3.3.3 FET前VEGF水平：Law等[24]研究表明在胚胎移植后成功受孕的女性中，VEGF在内膜基质表达高于胚胎移植后未受孕的女性。另有研究表明：与对照组相比，反复移植失败组外周血VEGF水平显著降低[25]；我们的数据显示内膜转化后血VEGF水平均高于转化之前，内膜转化前后妊娠者和非妊娠者血清VEGF浓度没有显著差异。