SERPINE1的表达与胃癌预后及肿瘤免疫细胞浸润的生物信息学分析

吕坤 乐奇 王军 姜雷 姚南

研究显示，每年有新增超过100万的胃癌病例，为世界上第五大最常见的癌症，也是继肺癌和结直肠癌之后的第三大癌症死亡原因，而且在亚洲的发病率明显高于其他地区[1,2]。肿瘤复发和转移是其预后不良的重要因素，而免疫相关机制参与了肿瘤的发生、发展、转移和复发[3,4]；而免疫治疗在临床上已被广泛使用[5]。已有的研究报道了免疫治疗在许多晚期实体瘤中的显著疗效[6]。在转移性或复发性胃癌患者中，几乎所有MSI-H亚型的胃癌患者接受了帕博利珠单抗的治疗后有显著疗效[7]。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)、程序性死亡1(PD-1)和程序性死亡配体1(PD-L1)抑制剂在治疗转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌和肾细胞癌方面显示出更明显的抗肿瘤效果[7-9]。然而，抗CTLA4、抗PD-1和抗PD-L1治疗晚期胃癌的临床疗效并不显著。肿瘤细胞的免疫反应主要由CD8阳性细胞毒性T细胞诱导，导致一系列的阶梯式和级联式反应(所谓的癌症免疫循环)，一些受体及其配体促进或抑制癌症免疫循环的每个步骤[10]。免疫治疗的疗效似乎与肿瘤的免疫微环境和免疫反应的表现有关，临床试验证明，肿瘤微环境中的各类免疫细胞和基质细胞在肿瘤化疗和免疫治疗的临床疗效和疾病预后中具有明显的相关性[4,11]。因此，深入了解胃癌的发病机制和免疫相关机制，找到更敏感的免疫治疗靶点至关重要。

1 材料与方法

1.1 TCGA数据库分析 为了探索SERPINE1作为胃肠道肿瘤预后生物标志物的潜力，我们使用癌症基因组图谱(TCGA)RNA-seq数据集[12]下载了胃癌的临床信息数据，并对转录组分析数据进行处理，对所有数据进行对数转换。缺少随访数据的样本被排除。使用Strawberry Perl(5.32.1版)软件将原始转录组数据整理成基因表达矩阵文件。最后，使用 “limma[13]”、“beeswarm”和“ggpubr”将数据可视化。R软件(版本4.0.3)软件包来可视化和分析数据。

1.2 PrognoScan数据库分析 利用PrognoScan数据库搜索SERPINE1的表达水平，确定其与预后的关系，包括总生存期(OS)和无病生存期(DFS)[14]。

1.3 Kaplan-Meier plotter分析 Kaplan-Meier plotter是利用从GEO、EGA和TCGA数据库下载的癌症患者的基因表达数据和生存信息创建的在线数据库。它有效地提供了21种癌症的54 k个基因(mRNA、miRNA、蛋白质)的生存影响[15]。我们使用Kaplan-Meier plotter数据库来研究SERPINE1 mRNA在胃癌患者中的临床预后意义。采用Kaplan-Meier单变量和Cox多因素生存分析法来分析SERPINE1表达与生存的相关性。最后，利用R软件(4.0.3版)对Kaplan-Meier绘图仪中的胃癌OS(总生存期)和PFS(无进展生存期)的相关预后信息进行了直观分析。

1.4 TIMER数据库分析 TIMER是一个在线数据库，研究恶性肿瘤细胞和宿主免疫系统之间的相互作用，并阐明复杂的肿瘤-免疫相互作用，包括来自TCGA的32种癌症的10 897个样本，用以估计免疫浸润的程度[15]。我们通过基因模块分析了SERPINE1与B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞浸润程度之间的关系。我们进一步进行Kaplan-Meier曲线分析，探讨基因表达或免疫细胞浸润对患者生存的影响。

1.5 GEPIA数据库分析 GEPIA是一个在线数据库，包含了来自TCGA和GTEx的9 736个肿瘤和8 587个正常样本的RNA测序表达数据，可用于基因表达谱的交互分析[16]。我们使用GEPIA来评估SERPINE1的表达与肿瘤免疫细胞浸润相关的特定标记物的表达之间的关联，并验证SERPINE1在胃癌中的表达与其较差的预后之间的联系。

1.6 GSEA基因组富集分析 使用MSigDB的C7.all.v.7.4symbols.gmt作为目标集，使用从Broad Institute下载的GSEA软件(4.1.0版)分析所有肿瘤病例。使用了默认的加权富集统计方法。随机组合的数量被设置为1 000，其他参数被设置为默认值。只有NOMP<0.05的基因组被认为是具有统计学意义的明显富集的基因组。

1.7 统计学分析 从TCGA获得RNA-seq数据集，并对所有数据进行了Log2转换，GEPIA和Kaplan-Meier绘图仪使用对数rank检验来计算HR和其P值来比较生存曲线，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 利用TCGA和TIMER数据库分析SERPINE1在不同肿瘤和正常组织中的表达。

2.1.1 利用TCGA和TIMER数据库来评估SERPINE1在33种肿瘤类型中的差异。在TIMER数据库中下载SERPINE1在33种肿瘤类型中表达图片，结果发现，SERPINE1在乳腺浸润性癌、结肠腺癌、食道癌、头颈部鳞状细胞癌中呈差异表达。肾脏透明细胞癌，直肠腺癌，胃腺癌，甲状腺癌的表达明显高于正常对照组。在肾嫌色细胞癌、肾脏肾乳头状细胞癌、肝脏肝细胞癌、子宫内膜癌组织中，SERPINE1的表达量明显低于正常对照。见图1。

图1 SERPINE1在不同类型的人类癌症中的表达水平

2.1.2 从TCGA数据库中下载了胃癌的转录组分析数据和临床信息数据其中包括375个肿瘤组织和32个正常组织，并分析了SERPINE1在胃癌组织和正常组织中的表达，结果显示SERPINE1在胃癌中的表达明显高于正常组织(P<0.001)。见图2。

图2 TCGA数据库中SERPINE1在正常和癌组织样本中的表达

2.2 胃癌中SERPINE1的高表达与胃癌的浸润深度有关并影响预后 我们从TIMER数据库发现，SERPINE1的表达与胃癌患者的预后不良有关。然后我们进一步利用Kaplan-Meier plotter数据库来评估SERPINE1表达与胃癌患者临床病理之间的关系，以探索其潜在机制。其中，胃癌患者的总生存期和无进展生存期与性别、T期、M期和SERPINE1高表达明显相关。此外，SERPINE1 mRNA的高表达与胃癌3至4期患者的OS和PFS恶化有关，但与2期(OSHR=1.58，P=0.14；PFSHR=1.82，P=0.083)和N3期患者(OSHR=1.58，P=0.097；PFSHR=1.55，P=0.11)无关 。此外，在四个T分类中，SERPINE1高表达在T4的总生存期和无进展生存期中具有最高的HR，表明SERPINE1的表达水平可以影响胃癌患者T分期，从而影响患者的预后。见图3。

图3 SERPINE1的表达与胃癌临床参数的关系；SERPINE1与病理参数的单变量和多变量Cox分析

2.3 SERPINE1的表达与免疫浸润的关系 胃癌通常表现为广泛的局部肿瘤浸润，并经常扩散到转移部位，特别是淋巴结。恶性肿瘤的扩散是一个多步骤的过程，肿瘤入侵的许多阶段需要降解或破坏肿瘤细胞周围的细胞外基质和结缔组织[17]。而淋巴细胞渗入肿瘤的频率不仅可以独立预测淋巴结转移，还能影响患者的预后[18]。因此，我们利用TIMER数据库[15]研究了33种癌症类型中SERPINE1的表达是否与免疫浸润的水平相关。结果显示，SERPINE1在26种癌症中的表达与肿瘤纯度(肿瘤组织中肿瘤细胞所占比例)明显相关，在18种癌症中与B细胞浸润水平相关。此外，SERPINE1的表达与28种癌症的CD8+T细胞、18种癌症的CD4+T细胞、27种癌症的巨噬细胞、30种癌症的中性粒细胞和30种癌症的树突状细胞的浸润水平明显相关。

2.4 探讨SERPINE1表达与免疫标志物的相关性，验证SERPINE1表达在胃癌临床预后中的价值 肿瘤微环境(TME)由多种细胞类型组成，包括血管、免疫细胞、基质细胞和细胞外基质，它们对肿瘤的发生、发展至关重要，并参与了肿瘤的免疫逃逸机制[19]。因此，为了进一步了解SERPINE1与不同浸润免疫细胞类型之间的关系，我们利用GEPIA数据库[16]分析了SERPINE1与各免疫细胞类型的特征基因之间的相关性，从而分析SERPINE1通过调节免疫细胞改变TME，导致肿瘤的发生、发展以及免疫逃逸机制的发展的表达水平。利用GEPIA数据库进一步验证SERPINE1在STAD中的表达与这些标志物之间的关系，发现SERPINE1与Treg、T细胞耗竭、单核细胞、TAMS和M2巨噬细胞的标志物之间的相关性与TIMER数据库相似。SERPINE1与树突状细胞对肿瘤的侵袭密切相关。DC能够通过增强Treg反应和抑制CD8+T细胞的杀伤力来提高肿瘤转移的水平[20].从而证实了SERPINE1与STAD免疫浸润细胞的特异性关联，表明SERPINE1在胃癌TME的免疫逃逸中具有重要作用。此外，我们通过GEPIA数据库发现，SERPINE1的表达与胃癌较差的总生存期(P=4.8e-05)和无病生存期(P=0.005)明显相关。见图4，表1。

图4 GEPIA在线数据库的胃腺癌(STAD)总生存期和无病生存期的Kaplan-Meier图

表1 SERPINE1在胃癌中表达与GEPIA数据库中的单核细胞、TAM、M2巨噬细胞、调节性T细胞和T细胞耗竭的标志物之间的相关性分析

2.5 基因组的富集度分析 我们从TCGA数据库下载胃癌转录组分析数据和临床信息数据，用GESA做KEGG信号通路富集分析。KEGG分析从上至下，从左至右依次显示为：趋化因子信号通路，细胞粘附分子，补体和凝血级联，ERBB信号通路，FC γ R介导的吞噬作用，白细胞跨内皮迁移，造血细胞系，自然杀伤细胞介导的细胞毒性。核苷酸结合寡聚域(NOD)类受体信号通路、Toll类受体信号通路、mTOR信号通路和T细胞受体信号通路是肿瘤免疫相关基因交叉富集的主要途径；其中淡绿色曲线表示富集度分数概况，灰色区域表示指标排名分值。见图5。

图5 GSEA分析结果，筛选出高免疫分数组和低免疫分数组之间的重要通路;GSEA，基因集富集分析;“H”，正相关;“L”，负相关

3 讨论

近年来，在胃癌的生物学以及手术和免疫治疗方面取得了很大进展，但由于缺乏胃癌的早期诊断方法和有效的生物标志物，导致大部分胃癌患者进展到中晚期，导致预后不良，是人类面临的一大威胁[20]。因此，寻找新的免疫相关疗法来治疗胃癌，是研究人员改善患者预后、延长患者生存时间的迫切需求。

SERPINE1，也被称为血浆蛋白原激活剂抑制剂1(PAI-1)，是丝氨酸蛋白酶抑制剂(SERPIN)家族的重要成员。SERPINE1是尿激酶和组织蛋白酶原激活剂(uPA和tPA)的一个主要抑制剂。过去的研究集中在SERPINE1对血栓形成的影响。然而，SERPINE1在各种类型的癌症中的作用已成为一个研究热点。凝血酶原激活剂系统在细胞外基质重塑中起着关键作用，这与肿瘤的进展和转移密切相关[21,22]。大量研究表明，SERPINE1具有促血管生成作用、抗凋亡作用[23,24]，还能诱导肿瘤血管化，激活炎症反应[25,26]。此外，SERPINE1受多种信号的调控，主要是生长因子和细胞因子以及激素和环境压力，如缺氧，而这些信号大多是促进肿瘤的因素[27]。这些都有力地表明，SERPINE1可能在肿瘤的发生、发展、转移和侵袭中起着关键作用。SERPINE1的高表达也是对化疗不敏感的一个肿瘤预后不良的因素[28,29]，越来越多的研究报道SERPINE1在多种癌症中过表达，如胃癌[30]，食道癌[31]，头颈癌[32]，非小细胞肺癌[33]，和恶性黑色素瘤[34]，提示SERPINE1的表达与临床预后有关。然而，SERPINE1在与免疫浸润相关的机制中的作用目前还不清楚。因此，我们在此研究SERPINE1表达水平的变化与胃癌预后相关，尤其是SERPINE1的高表达与胃癌预后不良密切相关。SERPINE1表达水平的升高可以影响胃癌的浸润程度，从而影响患者的预后，这表明SERPINE1的表达可以作为肿瘤转移的预测指标。此外，我们的分析显示，免疫浸润的程度和不同的免疫标记物组与胃癌的SERPINE1表达水平相关。因此，我们的发现有助于将SERPINE1作为胃癌的预后潜在生物标志物，并将对这种潜力的理解扩展到临床其他相关的亚型。

免疫细胞在TME中的浸润不仅可以影响肿瘤细胞的生存、转移和侵袭，还可能与免疫治疗过程中的治疗耐药性密切相关[31,32,35,36]。而我们发现SERPINE1的表达与胃癌中不同类型的免疫细胞的浸润水平相关：SERPINE1的表达水平与CD8+T细胞和B细胞的浸润水平呈弱正相关，与巨噬细胞、自然杀伤细胞和DC细胞呈明显正相关。SERPINE1的表达与免疫细胞标志物的相关性表明，SERPINE1对STAD的抗肿瘤免疫有调节作用。

而后，通过对KEGG信号通路的富集分析，我们发现自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号通路是调节免疫环境的重要通路，在调节肿瘤免疫过程中发挥着重要作用[37]。自然杀伤细胞(NK-cell)，是一种对先天免疫系统至关重要的细胞毒性淋巴细胞。NK细胞对病毒感染的细胞有反应，对肿瘤的形成也有反应，在没有抗体和MHC的情况下，识别受压细胞的能力可以使免疫反应更快，也可以破坏不能被其他免疫细胞检测和破坏的细胞[38]。 此外，NK细胞分泌一些细胞因子、趋化因子和生长因子，如IFN-γ、TNF-α、转化生长因子β(TGF-β)、巨噬细胞炎症蛋白-1β(MIP-1β)、RANTES和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)增强抗肿瘤免疫力，它们还表现出记忆样细胞特征[39]。然而，最近有研究表明，恶性肿瘤由于肿瘤微环境中低浓度的葡萄糖、高浓度的乳酸和低pH值引起的细胞代谢受损，从而导致NK细胞功能紊乱使NK细胞的抗肿瘤反应受损[40,41]。因此，进一步了解SERPINE1与自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号通路之间的联系可能在胃癌的免疫治疗方面有更大的突破。

综上所述，我们通过研究发现，SERPINE1的表达与胃癌患者的总体生存和预后、多种类型的免疫浸润和免疫过程有关。该基因可被视为判断预后的生物标志物，也可作为胃癌治疗的标志物，这可能是胃癌免疫治疗的一个重点。与其他类似的研究一样，本研究的主要数据来自于生物信息学，所以本研究的证据仍然是间接的。对SERPINE1的进一步研究可能会对肿瘤微环境与胃癌免疫治疗和预后之间的潜在关系带来新的启示。