蛋白质组学技术在探析抑郁症潜在生物标志物的研究进展

樊帅，金红，高美云，高敏香，齐泰煜，梁莹，钱家坤，谢雨虹，李光英，张敏

（1.长春中医药大学针灸推拿学院，长春 130117；2.长春中医药大学中医学院，长春 130117；3.长春中医药大学附属医院脑病中心，长春 130117；4.长春中医药大学附属医院针灸临床中心，长春 130021）

抑郁症作为一种常见的神经精神障碍疾病，受此病影响的人数约占世界人口的10%，并呈现日益增长的趋势[1]，除其可致残、致死之外，因抑郁症并发症导致患者过早死亡的风险亦有增加[2]。因患者的个体差异、病情的强隐匿性及致病因素的多样性导致临床误诊漏诊率高，加之现有诊疗手段单一，缺乏统一的客观标准，且药物治疗效果差强人意，不良反应多，复发率高，因此，抑郁症的诊疗手段亟待提高。此病发生发展的分子机制目前仍不明，现有多种假说指出其病因可能是由环境、基因、机体异质等多种具有重叠的因果途径相互作用产生，相关研究亦表明[3]此病发生发展可能与机体的神经营养、炎症因子、生物代谢密切相关。近些年，现代科学指导下的蛋白质组学技术平台的搭建为进一步认识此疾病提供了新切入点，生物标志物的研究作为区别于传统行为学的生物学研究方法，可以针对蛋白质、基因和脑部组织等进行标定测量，为抑郁症的诊断提供明确的客观依据[4]。因此，生物标志物的选取对于抑郁症发病的风险评估、病种分类、病情诊断、用药指导及预后康复显得非常重要[5]。本文对蛋白质组学在不同样本中筛选抑郁症生物标志物的研究情况作简要论述。

1 脑组织

1.1 脑脊液 脑脊液（CSF）与脊神经和颅神经的脑膜鞘相接[6-7]，可作为潜在生物标记物的候选来源。时宝林等[8]选取8 例抑郁症患者与正常组对照，提取试验对象的脑脊液分析，结果提示试验组与对照组相比，抑郁症患者脑脊液中Apo D 和血浆视黄醇结合蛋白种蛋白表达下调，poAI 蛋白表达上调。李惠珍等[9]通过大鼠脑脊液对药物抗迟发性抑郁症神经发生障碍的机制进行探究，分析发现在实验大鼠中共检测出蛋白2 620 个，对照组与迟发性抑郁症与实验组比较，共有差异蛋白176 个；其中GhR、GDF11、NrCAM、NTRK2 与神经密切相关。

实验研究指出脑脊液（CSF）中蛋白有望成为抑郁症的候选生物标志物[10]，目前在脑脊液中的蛋白质组学研究中已经明确有1 个以上被鉴定出有效差异蛋白的生物标记物已有42 个，这些蛋白生物标记物的诊断潜力以及其与指向的抑郁症病理学有直接的关联性[11]。在未来使用生物信号检测手段可能是一个对抑郁症进行确诊或者区分抑郁症与其他神经精神障碍疾病较好的策略，但由于抑郁症患者的异质性，迄今为止，抑郁症患者脑脊液提取物中蛋白变化的直接证据和报道甚少，在不同实验对照中亦体现出一些相互矛盾的结果[12]，所以人体脑脊液的提取手段及蛋白筛选方式值得关注。

1.2 海马组织 海马体是脑边缘系统中的一部分，位于丘脑与内侧颞叶之间，侧脑室下角的下壁和侧壁上，与情绪相关的大脑区域（如前额叶皮层）的神经纤维相连接[13]。海马神经元的凋亡或衰退可造成学习记忆、情绪调节功能的损伤。动物实验中，对大白鼠和猴子长期慢性应激后，可观察到其海马神经元树突萎缩凋亡[14-15]，神经影像学亦提示，抑郁症患者和造模成功的动物模型的海马体积均有出现缩小的现象[16]。胡永波[17]在有效提取2 组抑郁症大鼠的海马突触蛋白后，采用凝胶电泳和质谱检测手段对差异蛋白质组学进行分析。试验组得到表达中上调的蛋白质共6 个，下调的蛋白共10 个，经分析发现这些蛋白质在递质释放、能量代谢、物质代谢、囊泡调节、信号转导中发挥着重要作用。胡永波[18]在此基础上对后续与抑郁症相关蛋白功能进行预测，发现了6 个与突触传导功能障碍可能相关的蛋白质：网格蛋白轻链A、网格蛋白轻链B、发动蛋白1、突触素2 及囊泡融合ATP 酶、囊泡ATP 合酶亚单位E1；2 个兴趣蛋白：网格蛋白轻链A、网格蛋白轻链B。经验证，本研究同之前双向电泳试验结果基本相同。曹莉莎等[19]运用绝对定量（iTRAQ）蛋白质组学技术结合LC-MS/MS 分析抑郁症大鼠的海马组织内差异蛋白质，共发现33 个差异蛋白，其中表达上调蛋白8 个，表达下调蛋白25个。高耀等[20]亦使用此技术对抑郁症造模成功的大鼠海马组织蛋白进行功能富集分析后采用Western blot探究大鼠海马体的蛋白表达，共鉴别出下调的蛋白11个：Pmm2、RGD1311899、Ndufs6、Cplx1、Krt10、Ndufab1、Fkbp8、Pafah1b3、Sh3bgrl3、Tbca、Fth1。廖伟[21]使用iTRAQ 和平行反应监测（PRM）技术检测海马突触受损后前额叶皮层的蛋白变化，共鉴别出差异蛋白212 个，其中PRM 鉴定到Gfap、Grm2、Spred1、Ppp1r1a、Uqcrh、Tubb6、Ppp1r1b、Gnai2、Urod、Cul1、Gpcpd1、Acadl、Mtor、Lsm8、Cplx2、Rhog、Tsta3 具有显著差异，对海马体神经的关联性进行了验证。

总的来说，目前已收集了大量抑郁症海马体应激相关的差异蛋白并构建了基础框架，为探索抑郁或焦虑的抵抗性、敏感性分子潜在生物标志物提供了参考[22]。尽管iTRAQ 技术与LC-MS/MS 技术作为目前主流的组学蛋白检测手段为探究抑郁症的生理病理分子机制提供了有力支持[23]。但因动物与人体差异巨大，人体活体海马取材条件苛刻，抑郁症个体异质性强的特点等限制，很难通过一个单一的、不分层次的对海马体整体的研究来清晰的阐述抑郁症与海马体之间的关联性。若从抑郁症核心症状的病理角度出发，将不同症状的病理机制整合后对其个体化、类别化，将有利于筛选典型生物标志物和阐明海马组织病变与抑郁症的关系。

1.3 下丘脑 下丘脑是调控机体应激反应的核心脑区和调节内分泌系统与神经系统的关键枢纽，临床及动物实验中发现抑郁症发病时常累及此区域[24]。饶承龙[25]选取抑郁模型组与对照组小鼠各15 只。行为学评价后对其中9 只小鼠的下丘脑进行差异蛋白鉴定，共获得37 个差异蛋白，其中表达上调蛋白13 个，表达下调蛋白24 个，分析提示这37 个差异蛋白主要与氨基酸代谢、糖代谢及谷氨酸能神经突触的异常相关。另有研究[26]基于iTRAQ 和气相色谱-质谱（GC-MS）技术对脂多糖（LPS）诱导下的模型小鼠的下丘脑蛋白质进行分析。共筛选出具有差异表达的蛋白质187种、代谢物27 种，发现脑源性神经营养因子（BDNF）、下丘脑突触后密度蛋白-95（PSD-95）、p-AKT 可能与突触可塑性的调节相关；EPHB2 蛋白可能与谷氨酸能传递功能障碍具有一定关联性。

下丘脑病变可导致神经突触功能异常，可能是炎症型抑郁症患病的重要因素，但在目前的抑郁症发病病理机制研究中，下丘脑的生物标志物挖掘少有报道。所以阐明抑郁症患者下丘脑结构功能的改变，挖掘潜在生物标志物可能为揭示其与蛋白表达谱联动的关系提供新的理论依据。

2 体液

2.1 外周血 徐红波[27]选取抑郁症患者与健康对照组各21 例，抽取抑郁症患者外周循环血液后使用凝胶电泳和iTRAQ 技术对血浆进行检测分析，试验发现差异蛋白9个，其中5个表达上调的蛋白：α白蛋白（AFM），载脂蛋白D（Apo D），α1B 糖蛋白（A1BG），载脂蛋白B100（Apo B100），维生素D 结合蛋白（VDP）。4 个表达下调的蛋白：信号素3F（S3F），富含组氨酸的糖蛋白（HRG），铜蓝蛋白（Cp），以及α2 巨球蛋白（A2M），ApoB100 和A2M 两个蛋白表现出的高特异性值得我们进一步挖掘。詹远[28]选取卒中后抑郁症患者及健康者对照组各15 例，去除高丰度蛋白后对3 组受试者的血液样本进行分析，筛选出表达显著下调蛋白3 个：LRG、ApoC-IICRP、haptoglobin。表达上调蛋白1 个：gelsolin。提示gelsolin 蛋白表达量上调与haptoglobin 蛋白表达量下调可能会是诊断卒中抑郁症患者潜在的生物标志物。詹远等[29]在前期研究基础上再次对载脂蛋白A-IV（ApoA-IV）和富含亮氨酸的α-2-糖蛋白（LRG）、载脂蛋白C-II（ApoC-II）、C-反应蛋白（CRP）、凝溶胶蛋白、触珠蛋白进行蛋白检验分析。发现与中风受试者相比，卒中后抑郁患者ApoA-IV 蛋白表达上调；卒中后抑郁患者和健康受试者血浆中ApoC-II、CRP 和LRG 蛋白表达下调，表明免疫调节和脂质代谢的紊乱可能是导致卒中后抑郁症发病的重要因素。有研究[30]选取7 名抑郁症患者和7 名健康者，采用生物信息学结合机器学习方法筛选出高特异性蛋白ITIH4 蛋白和VDB 蛋白，认为其可作为抑郁症患者血液中潜在的生物标志物。Ryan等[31]基于电休克疗法（ECT）对抑郁症患者与抑郁症造模成功的大鼠外周血蛋白质组变化的分子机制进行探究，质谱鉴定出显著改变的蛋白质36 个，其中PEDF 蛋白表达显著上调，评估大鼠脑和血液中mRNA 蛋白水平发现PEDF 蛋白亦有变化，提示PEDF 蛋白可作为评估抑郁症病情变化的生物标志物。有研究[32]利用微阵列技术在抑郁症患者外周血中探索lncRNA 与mRNA的共表达模式，筛选出具有差异表达的lncRNA 蛋白2 007 个、mRNA 蛋白1 667 个，发现mRNA 与基本代谢、神经发育密切相关。通过使用质谱分析抑郁症患者血清后筛选出2个下调蛋白：锌-α-2-糖蛋白（ZA2G）和角蛋白II 型细胞骨架1（K2C1），发现其与色氨酸代谢相关，色氨酸代谢作为激肽释放酶系统中合成血清素的重要途径，K2C1 参与其中，该系统可产生缓激肽抗炎介质，而MDD 与炎症因子高度相关，提示ZA2G、K2C1 可作为外周血潜在生物标志物进行探究[33]。有研究[34]对血清中凝血酶进行探究时发现抑郁症患者血清中的蛋白酶原受体受到凝血酶的激活后进一步诱导血小板的过度激活，而活化的血小板分泌出与抑郁症相关的脑源性亲神经因子和血清素，这也验证了外周血可作为炎症因子的介导物质参与抑郁症分子机制的理论。通过采集99 例帕金森病抑郁症患者空腹血浆样品后对其进行鉴定，筛选出17个差异蛋白，富集了12 个与葡萄糖代谢相关的途径，其中强特异性NOTCH2 蛋白的变化与抑郁症发病轻重为正相关，提示其可能是的抑郁症患者潜在血液生物标志物[35]。

外周血的采集成本低，痛苦小，可重复性高，且其中蕴含大量蛋白信息，涉及到蛋白酶、炎症因子，神经营养因子、血清素等多个抑郁症相关生物标志物热点领域[36]，但因其信息的重叠性和复杂性，目前尚不能清晰的对其分子机制进行完整地阐释，一些作者试图建立针对血液的整体网络架构，从多角度检测血浆中蛋白变化对抑郁症生物体的影响和干扰，这为缩小筛选血浆中潜在生物标志物范围提供了方向。

2.2 尿液 彭扬[37]采集了试验组和对照组各30 例的尿液样品。解离分析后选取兴趣蛋白进行Western blotting 验证。共得到差异蛋白35 个，其中表达上调蛋白22 个，表达下调蛋白13 个。经质谱分析筛选出蛋白29个，对其中5个兴趣蛋白：α-烯醇化酶（ENO1）、选取精氨酸琥珀酸合酶（ASS1）、丝氨酸蛋白酶抑制剂B3（SERPINB3）、多配体聚糖结合蛋白亚型2（SDCBP）、神经节苷脂GM2 激活物（GM2A）进行进一步验证后，结果均提示存在显著差异，可作为候选生物标志物。研究[38]通过采集首发抑郁症患者和对照组的尿液样本，筛选出27 个差异蛋白，分析后得出了与研究[37]相同结论。有研究[39]基于核磁共振波谱对44名首发抑郁受试者和52名健康者进行对照试验，筛选出3 种尿液代谢标志物：丙氨酸甲酸盐、羟苯乙酸盐丙二酸盐、n-甲基烟酰胺。经特征曲线（AUC）尿蛋白验证后证明可作为是诊断MDD的潜在标志物。

尿液样本相对提取其他生物标志物来说取样简便快捷、成本低、无痛苦，试验[40]表明抑郁症患者的尿液中去甲肾上腺素指标与脑脊液、血液变化为正相关。因此尿液可作为潜在生物标记物挖掘点对抑郁症病理机制进行阐释。

2.3 肠道菌群 诸多试验结果表明，肠道菌群与抑郁症生理病理机制具有一定相关性[41]，脑肠轴中的蛋白质改变亦与生物的代谢及炎症反应密切相关，肠道中的能量代谢可能是导致蛋白质网络发生改变的重要因素。通过将抑郁症患者的肠道菌群转移到实验动物小鼠体内，对造模成功的小鼠进行蛋白组学分析后发现，肠道微生物可导致脑肠轴中多个组织的蛋白表达发生改变[42]。选取129 名活动期溃疡性结肠炎患者、49 例抑郁焦虑患者与62 例健康人进行对比观察，并对受试者肠道菌群进行蛋白组学测序分析后发现，伴有抑郁或焦虑的溃疡性结肠炎患者比不伴抑郁或焦虑的溃疡性结肠炎患者粪便内微生物菌群丰富度和多样性降低，血清中免疫球蛋白亦有减少，提示肠道内菌群、代谢产物与蛋白质的改变密切相关[43]。

肠道菌群失调和代谢功能紊乱在行为学上已被证实是抑郁症病理表现和发病诱因之一，近期的生物学研究亦表明抑郁症患者脑肠轴中相关蛋白发生了联动式改变[44]，虽然其对应关系在分子机制角度目前并没有被清晰地阐明，但此发现为使用蛋白组学技术从脑肠轴中挖掘潜在生物标志物提供了思路。

3 小结与展望

本研究通过使用蛋白质组学方法对生物组织中潜在标志物进行探析，此技术能够更加直观、准确的观察抑郁症患者各组织中的相关蛋白变化，以便对临床上单一诊断手段进行革新与补充。生物的脑组织、尿液、血液、粪便中携有大量的蛋白信息，使用蛋白组学技术可对其中的糖代谢、氨基酸代谢、神经营养、活血酶、炎症因子等生物标志物的结构功能和联动关系进行探析归类，丰富了蛋白组学领域的研究成果，同时也提高了抑郁症确诊工作的准确性，对抑郁症患者病情进展的监控、个体化用药指导、研制新抗抑郁药物等提供了生物学方向。

蛋白质组学检测平台的搭建及检测理论的日益完善，为挖掘和阐明单个兴趣蛋白的作用机制提供了基础。酶联免疫吸附测定法、放射免疫测定法、基质辅助激光解吸电离技术等已被证明可对生物标志物进行快速筛选的手段，已被广泛应用于差异蛋白的遴选工作中。与此同时，基因组学、神经生理学、神经成像学、代谢组学等技术与蛋白质组学技术相互验证配合，在生物标志物探究领域取得了一定成果。多种手段相结合对蛋白进行筛选及验证日益成为筛选兴趣蛋白的主流思想。但因目前蛋白组学技术在抑郁症临床及实验领域应用尚不广泛，故筛选具有特异性兴趣蛋白时，受影响于样本数量、工具精度、实验人员技术等无关变量，导致测定结果波动较大，且介于实验方式、研究角度、临床入组样本量参差不齐，获得的生物标志物之间功能结构分歧颇多，甚至一些结论相互矛盾，给不同生物标志物间功能的相互印证制造了一定困难，虽然技术的发展为其提供了更好的探索环境，但这种外界环境的提升并没有高效率地转化为实验和临床成果，所以临床工作者不仅需要根据患者的症状、体征，结合量表及生化等相关辅助检查，对患者尽早诊断治疗，减少抑郁症给患者及家庭带来的痛苦与损失，更应从多角度对抑郁症状与差异蛋白的相关性并详细记录，以期能够从中获得更具有代表性的相关标记物，为抑郁症及相关精神类疾病的诊断和治疗开辟新思路、新方法。值得肯定的是，从大量的临床与动物实验中筛查出的特异性蛋白证据看来，抑郁症的发生发展确与脑组织、脑脊液、海马组织、下丘脑、外周血、尿液、肠道菌群等生物组织结构的蛋白升降存在密切相关性。因此，整合性的构建生物标记物网络架构，而不是单独的关注某一差异蛋白的功能结构，并采用多种方法联合，探析差异蛋白及蛋白间的相关性，可能是未来探索人体潜在生物标志物更好的突破点。