先天性巨大黑素痣的发病机制及其靶向治疗的研究进展

王嘉厅 综述，吴信峰 审校

（中国医学科学院皮肤病医院整形美容外科 江苏 南京 210042）

先天性巨大黑素痣（GCMN）是一种神经嵴起源的皮肤黑素细胞良性增生，不仅严重影响患者外观，给患者造成极大的心理压力，而且相关研究证实GCMN患者会有一定几率并发神经皮肤黑变病（Neurocutaneous melanosis,NCM）和恶性黑素瘤（Malignant melanoma,MM）。目前，对于GCMN的病因及发病机制尚不明了，对GCMN的治疗亦尚无满意的方法。非手术治疗主要有化学剥脱、激光等，虽然能够改善局部外观，但并不能完全清除真皮深层及皮下组织的痣细胞，因此仍然存在复发甚至恶变的可能性；手术治疗是主要的治疗方法，但是手术治疗的效果往往不尽如人意，而且治疗周期长，并发症多，影响患者的生活质量。本文从分子生物学的角度，主要针对GCMN的发病机制及其靶向治疗进行阐述，来探讨靶向治疗GCMN的效果。

1 GCMN的发病机制

目前，GCMN的病因及发病机制尚不明了，从分子生物学的角度研究，发现多种基因突变及明星信号通路的激活对GCMN的形成和发展至关重要。

1.1 RAS/ERK信号通路：RAS基因是一种在生物进化过程中高度保守的原癌基因，其与细胞增殖、分化、凋亡及迁移密切相关。通过合子后基因突变激活特定的信号通路已被证明与皮肤良恶性肿瘤的发生有关。通常，这些突变构成激活RAS家族GTP酶蛋白的一个亚型，即HRAS、NRAS或KRAS，并涉及第12、13和61密码子的热点突变[1]。这些RAS蛋白具有GTP/GDP结合和GTP酶活性，RAS基因突变导致RAS蛋白自身的GTP酶活性下降，使得RAS-GTP不能变成RAS-GDP而始终处于与GTP结合的状态，造成RAS-RAF-MEK-ERK通路过度激活，从而导致细胞的过度增殖与肿瘤的发生。

几乎所有的GCMN都是偶发的，认为GCMN是由偶发的合子后体细胞突变所致，同卵双生子的不一致性和病变的节段性分布也证明了这一点，但也有家族聚集性的报道[2]。对GCMN突变基因的研究大部分集中在NRAS和BRAF，其中体细胞NRAS突变（p.Q61K，p.Q61R）发生在50%～95%的患者中，而BRAF突变（V600E）频率为0%～40%[1,3-8]。其中，Charbel等[3]使用了各种敏感的检测方法研究GCMN，发现94.7%(18/19)的GCMN存在NRAS突变，并进一步使用全外显子测序对5个样本进行了评估，发现NRAS突变很可能是启动事件，因为没有发现其他突变具有更高的突变频率。但Stark等[6]认为，考虑到突变等位基因频率(Mutant allele frequency,MAF)，如果GCMN是由合子后NRAS突变引发和驱动的，则相应的MAF应该相对较高（MAF≥10%）。综上，鉴于GCMN中存在极高频率的NRAS或BRAF突变，可推测RASRAF-MEK-ERK信号通路中癌基因的激活突变似乎是GCMN形成的先决条件。此外，若相应的MAF较高则更能证实这一点。

GCMN中的NRAS和BRAF突变总是互斥的，即两种突变不共存于同一皮损中[1,3,5,7-8]。这表明它们可能在相同的RAS/ERK信号通路上发挥作用。在临床特征方面，NRAS突变的GCMN表现为体积更大、部位多发等，说明NRAS突变比BRAF突变的GCMN具有更强的生长信号，因为激活的NRAS可通过ERK和PI3K/AKT通路进行信号传导，而激活的BRAF只通过ERK信号传导[1,9]。除了促进细胞增殖，激活PI3K/AKT还通过刺激Rac1促进黑素细胞存活和定向迁移[10]。此外，NRAS突变同时激活这两种通路的能力可能导致NCM的预后相对较差；NRAS突变的GCMN表现出更大面积及多部位发病等特征也可能与延迟的癌基因诱导衰老（Oncogene-induced senescence,OIS）相关[1]。相关研究表明，NRAS突变的CMN都表达干细胞或祖细胞表型，如：Sox10、Nestin、Oct4等，并且这些CMN体积越大，增殖、克隆能力越强，恶性转化风险越高[11-12]。若GCMN表现为体积巨大，有多发的卫星痣病变等，则更倾向于存在NRAS突变，其恶性程度更高，预后相对较差，需进行早期干预以及长期随访。

1.2 Wnt/β-catenin信号通路：经典Wnt/β-catenin信号在胚胎发育和成人组织稳态中发挥着关键作用。Wnt是一类分泌型糖蛋白，通过自分泌或旁分泌发挥作用，接收Wnt信号的是跨膜受体FZD蛋白家族，随后通过下游蛋白激酶的磷酸化作用影响β-catenin的降解。当Wnt激活时，β-catenin的降解活性受到抑制，胞浆中稳定积累的β-catenin进入细胞核后结合LEF/TCF转录因子家族，启动下游靶基因（如c-myc、Cyclin D1等）的转录，其异常表达或激活能引起肿瘤[13]。

Kinsler等[11]研究表明，CMN同时表达细胞核和细胞质定位的β-catenin。Pawlikowski等[14]研究GCMN发现病变的黑素细胞巢显示出细胞核β-catenin及其促增殖靶点Cyclin D1和c-myc的一致表达，而正常表皮黑素细胞则不表达。同时，在小鼠模型中发现激活Wnt信号可以延缓或绕过黑素细胞的衰老，从而促进痣的形成；之后，持续激活的Wnt信号可能会破坏衰老介导的肿瘤抑制，增加恶性转化的风险。上述研究提示激活的Wnt信号与GCMN的形成相关，也可能参与GCMN恶性转化的过程。

此外，在转基因小鼠模型中，激活的Wnt信号促进了NRAS（p.Q61K）突变诱导的S100阳性黑素细胞增殖和皮肤黑化（S100B蛋白在大部分GCMN中高表达[15]），激活的Wnt信号可能与激活的NRAS在GCMN的发病机制中具有协同作用[14,16]。这说明Wnt/β-catenin通路和RAS/MEK通路中的明星分子在促进GCMN的形成过程中存在交互作用，但仍需要更多的研究来明确两者在GCMN发病机制中复杂的分子网络调控关系以及直接或间接的调控模式等。

1.3 Shh信号通路：Hedgehog (Hh)通路在成人组织维持、更新和再生过程中起到关键作用。Hh配体蛋白包括Shh、Ihh和Dhh蛋白；Hh信号传递受靶细胞膜上两种受体Ptc和Smo的控制，具有反馈调节机制；Hh通路的转录因子是Gli蛋白家族。正常情况下，Smo正向激活转录因子，但Ptc受体能抑制Smo蛋白活性，抑制下游通路，实现自我调节。异常活化的Hh信号转导会引发多种恶性肿瘤，包括典型的基底细胞癌和髓母细胞瘤等[17]。

Chitsazan等[18]研究发现，在NRAS突变的背景下，促进CMN发展的最佳候选基因是Cdon，它是一种主要在角质形成细胞中表达的Shh信号通路的正调节因子。Chitsazan等[19]进一步研究发现，在携带黑素细胞NRAS第61密码子突变的小鼠模型中，角质形成细胞Shh通路活性增加；通过角质形成细胞释放内皮素-1(Endothelin-1,Edn-1)，该模型能发展出巨大的先天性痣，并通过rescue实验验证了这一点，即使用Shh和内皮素拮抗剂抑制了小鼠的痣发育。这与Charbel等研究的结果一致，某些CMN细胞亚型仍表现出诸如克隆形成的潜能等特征，并在与相邻角质形成细胞协同作用时扩展成痣样结构，这可以解释痣的二次复发，以及痣在儿童成长过程中的自然扩张[20]。角质形成细胞Shh- Edn-1旁分泌信号也可能促进GCMN的发生，同时，从角质形成细胞的旁分泌信号通路出发，也为GCMN的靶向治疗研究提供了一个新的方向。

1.4 cAMP信号通路：MC1R是一个高度多态的基因，它与色素和非色素（DNA修复）的功能相关，是在黑素细胞中生成黑色素的关键控制器。当α-MSH刺激MC1R时，它通过腺苷酸环化酶（AC）激活产生cAMP；cAMP进而激活PKA，PKA通过CREB的磷酸化激活MITF的基因表达；最后通过酪氨酸酶（TYR）和Tyr相关蛋白（TYRP1和DCT）的上调，将褐黑素转换为真黑素的合成[21]。已知MC1R的变异与黑素瘤、基底细胞癌、鳞癌等皮肤肿瘤的发生密切相关。

Kinsler等[22]报道了英国GCMN家族中红发和雀斑患者的高患病率,并研究与胚胎系MC1R基因型的关联。在这项GCMN的研究中，发现V92M或R等位基因(D84E, R151C, R160W,D294H)的存在与较大的GCMN和出生体重显著相关，提示这些等位基因具有促进生长的作用。研究表明MC1R基因中胚胎系变异的存在可能调节GCMN的大小。与之相反，Calbet-Llopart等[23]研究分析MC1R变异对来自欧洲和北美不同国家的中-巨型CMN患者表型属性的影响，发现p.V92M变异或任何“R”等位基因的存在，无论是单独或联合，都与GCMN的成年后预测大小（Projected adult size,PAS）无关，表明MC1R基因型变异与GCMN的大小无关。然而，不能排除MC1R变异作为GCMN发展的危险因素，特别是在两个等位基因上都有MC1R变异的携带者中，还需要进一步的研究来阐明MC1R基因在GCMN发展中的作用以及是否与种族背景相关。

1.5 其他：除上述典型的基因突变和信号传导通路异常之外，GCMN也可能由其他不同的分子事件导致，包括其他基因的点突变和融合转录等。

Silva等[5]对21例GCMN患者（12例为经典型GCMN，9例为溢出型GCMN）病变部位进行多基因面板和RNA测序分析，结果显示2例无NRAS突变的经典型GCMN患者中存在ZEB2-ALK和SOX5-RAF1融合转录，而在溢出型GCMN患者中发现存在KRAS、APC和MET等基因突变。Stark等[24]则在野生型NRAS的GCMN中发现了另一些潜在的基因驱动突变，包括LFNG、TMEM2和MMR基因，代表了GCMN发展的替代机制。此外，还有学者报道了GCMN病变的皮损中同时存在胚胎系突变和体细胞突变[25-26]。可见，GCMN的基因型也存在较大的异质性，这或许是GCMN作为良性肿瘤的特点之一，由于肿瘤的恶性进展是多阶段的和基因突变累积的过程，上述基因在GCMN发展和恶变中的作用有待进一步研究。

2 GCMN的靶向治疗

针对上述发病机制，靶向这些基因突变以及异常的信号通路可能是GCMN的一种潜在治疗策略，国内外多位学者做了许多相关的研究。

2.1 生物信息学分析：Wei等[27]首次对GCMN进行了全面的转录组分析，利用生物信息学手段揭示了GCMN中p16诱导的细胞周期停滞，抗凋亡性和肿瘤抗原处理功能失常引起的免疫逃避；主要组织相容性复合体（MHC）I类介导的肿瘤抗原处理是GCMN中明显下调的关键途径，ITCH、FBXW7、HECW2和WWP1被确定为候选的枢纽基因。生信分析能够在一定程度上指导基础科研的实验设计等，上述的研究发现也为GCMN的靶向和免疫治疗提供了新的视角。

2.2 细胞实验：Qingxiong等[28]在GCMN中分离出原代痣细胞(GNCs)，应用vemurafenib和trametinib处理显著降低了GNCs的增殖并促进其凋亡，同时发现ERK信号的激活也被显著抑制并增加了GNCs中p53蛋白的表达。Basu等[29]用NRAS信号通路的特异性抑制剂(Vemurafenib, MEK162, GDC0941以及GSK2126458)处理来自4例NCM患者的脊髓、大脑和皮肤的病变细胞，发现这些抑制剂能够降低NRAS突变细胞的活力。Rouillé等[30]使用MEK和Akt抑制剂降低了成球试验中的痣球直径，并抑制了痣细胞的活力和增殖；然后用相同的抑制剂体外培养标准化的GCMN外植体，这导致表皮和真皮中的MelanA+和Sox10+痣细胞数量减少，并且不影响正常皮肤的黑素细胞。综上，体外细胞实验明确了靶向RAS/ERK通路治疗GCMN的可行性，靶向药物可以抑制病变细胞的活力和增殖、促进凋亡，但仍需要进一步研究这些抑制剂的细胞毒性等。

2.3 动物实验：在动物模型水平上，也有许多相关研究验证了靶向药物对GCMN形成和发展的影响。Pawlikowski等[16]利用NRAS和Wnt信号均激活的小鼠建立了CMN综合征的动物模型，并在小鼠出生后使用MEK抑制剂selumetinib治疗，可以很大程度上缓解这种小鼠模型中CMN综合征的皮肤、大脑和软脑膜中黑素细胞的大量扩张。Rouillé等[30]在免疫损害的Rag2-/-小鼠背上进行全厚的GCMN异种移植，然后使用MEK和Akt抑制剂皮内注射在这些异种移植物中，抑制剂能诱导痣细胞的急剧减少，并且这种效应在治疗结束后30 d仍持续存在，且两种抑制剂合用时治疗效果更加明显。同时，这种GCMN患者来源的异种模型的建立，能够在更符合人体本身环境的条件下为GCMN寻找新的治疗手段[31]。Shakhova等[32]建立了一个显著表达Sox10的GCMN小鼠模型，研究发现Sox10单倍不足可以抵消NRAS突变驱动的GCMN的形成，而不影响皮肤神经嵴衍生物的生理功能。此外，Chitsazan等[19]使用Shh和内皮素途径拮抗剂(分别为LDE225和Bosentan)靶向Cdon-Shh-Edn-1轴可抑制GCMN小鼠模型痣的形成，导致相关的黑素细胞增多症的消失。动物模型的建立和体内动物实验为研究GCMN的靶向治疗提供了更高等级的证据和可信度，就目前来看，考虑到与疾病的相似性，笔者认为GCMN患者来源的异种移植模型是一种较优的选择；同时也可积极寻找相应的自发性疾病动物模型，有利于排除干扰因素。

2.4 临床试验性治疗：Küsters-Vandevelde等[33]报告了1例患有NRAS突变的CMN和NCM的13岁男孩，在手术治疗不理想后，使用MEK162治疗，观察到与治疗前相比，治疗后病变样本中MIB-1和p-ERK蛋白水平表达降低，提示MEK抑制治疗的潜在影响。Mir等[34]报道了1例患有GCMN（AKAP9-BRAF融合基因驱动）的7岁女孩，在经过trametinib治疗后，顽固性疼痛和瘙痒症状迅速缓解，皮损的大小、质地和厚度也有了显著的改善。还有数据表明，这种BRAF融合基因激活的改变可能赋予MEK抑制的敏感性[35]。可见，虽然试验性的靶向GCMN治疗能在一定程度上缓解患者的症状，但属于极少数的个案报道，缺乏大规模的临床前试验和临床研究。

3 小结和展望

近年来，多种基因突变和信号传导通路的异常激活与GCMN发病机制的关系得到越来越多的研究证实，虽然根据目前相关的基础研究及临床资料尚不足以明确其发病机制，但对研究GCMN的靶向药物治疗有着良好的启示作用。针对GCMN的发病机制，由于其基因型和表型均存在较大的个体异质性，可进行全基因组关联分析（Genome wide association study,GWAS）来研究基因型与表型之间的关联或在大病例对照队列中进行遗传学研究等；针对GCMN的靶向药物治疗，随着高通量测序及芯片技术的发展，通过数据挖掘寻找候选的生物标记和潜在的治疗靶点，并通过体外细胞实验，建立动物模型（如异种移植）、临床实验来验证靶向治疗能否作为GCMN的辅助疗法，以避免重复的手术。值得注意的是，GCMN相比于MM涉及突变相对较少，靶向治疗耐药的几率或者会降低；局部皮内给药治疗皮损或穿过血脑屏障的系统给药治疗NCM能否降低其恶性转化风险等也仍需要更加广泛和深入的研究。随着精准医疗（Precision medicine）的理念趋于实践，靶向药物的治疗将有着良好的应用前景。