攀登科学高峰 探索生命奥秘——人工合成牛胰岛素

人工合成动机

在人体的生命活动中有 4种重要的分子: 糖类、脂类、蛋白质和核酸, 其中蛋白质有着自己独特的结构和功能, 它是组成人体细胞和组织的重要成分。毫不夸张地说, 蛋白质是生命的物质基础。如果能够实现蛋白质的人工合成, 这将是中国科学界的一项壮举。

合成具有生物活性蛋白质的难度在当时是显而易见的。1958年, 人工合成的最长肽段就是促肾上腺皮质激素的一个片段。因此, 有很多国际上的学术权威认为, 人工合成胰岛素在短时间内是不可能完成的事情。1955年, 当桑格第一次阐明胰岛素化学结构的时候, 英国《自然》杂志甚至预言: “合成胰岛素将是遥远的事情。”

1958年8月, 中国科学院上海生物化学研究所(简称“生化所”)的科研人员在集体讨论中提出要进行人工合成蛋白质的想法, 这一想法很快得到了当时与会者的一致赞成。当时正值新中国成立初期, 百废待兴, 科研工作者希望自己的工作能够为祖国作出贡献。当时生化所的科研人员在讨论时提出了 3个方面的研究课题, 一是关于肿瘤研究的; 二是关于放射生物学方面的; 三是基本理论研究课题。对于第 3个方面的问题,有人主张做结构, 有人主张做蛋白质的合成, 最终蛋白质的合成这一课题得到与会人员广泛支持, 被确定了下来。1959年, 这一项目也获得了国家重大科学技术项目立项。

确定合成方案

在确定了研究的课题内容之后, 生化所就开始进行相关的筹备。1958年秋, 生化所召开学术会议, 当时北京大学、复旦大学、上海有机化学研究所(简称“有机所”)等单位的工作人员都参加了此次会议。生化所的曹天钦做了合成胰岛素的选题报告。20 世纪 50年代末, 中国只有合成 8 肽的基础, 国际上也只能合成 13 肽。而胰岛素共有两条链, 一条是 21 肽, 还有一条是 30 肽, 总共是 51 肽。这在当时看来, 技术难度很大。因此, 当时中国各个科研院所和大学必须通力合作才有可能实现这一实验上的重大突破。

会后, 生化所便开始了人工合成胰岛素的摸索与实践。生化所由曹天钦、王芷涯、张友尚、陈常庆、杜雨苍组成领导小组进行统一指挥, 兵分五路: 第一路是有机合成, 由钮经义负责; 第二路是天然胰岛素的拆合, 由邹承鲁负责; 第三路是建立肽库和分离分析技术, 由曹天钦负责; 第四路和第五路是做酶的激活与转肽的工作, 由沈昭文负责。按照这个思路进行前期的研究。

人工全合成结晶牛胰岛素的关键学术问题之一, 是三对二硫键能否正确的连接、正确连接之后又能否形成具有活性的蛋白质构型。当时国际上天然胰岛素拆合中几乎观察不到重组合胰岛素的活性, 所以国外文献中对二硫键的正确连接率很悲观。但是当时生化所的研究人员坚信: 明知山有虎, 偏向虎山行! 在有难度的问题上啃骨头, 做攻关, 才能体现出我们的科研实力, 这对于当时百废待兴的科研工作和以后的学术研究也是极大的鼓舞!

1959年, 在沈昭文的领导下, 首先完成构建氨基酸的生产工艺, 实现胰岛素 B 链中的几个小片段的人工合成。在链的拆分和合成研究上, 邹承鲁和杜雨苍开始摒弃之前强氧化剂快速氧化的方法, 希望利用温和的实验方式来提高重组合后胰岛素的活性。1959年国庆前夕, 邹承鲁等人已经找寻出一种不同于以往的新的合成方法: 在不使用氧化剂的同时, 利用强碱性水溶液在低温下由空气缓慢反应得到重组产物。杜雨苍、张友尚等人又发现了这样一个重要的事实, 那就是天然的胰岛素 A、B 链经过磺酸化后, 可以分离纯化得到稳定的产物, 而且易于进行重组, 并得到 5%~10%的胰岛素活性产物。由于实验保密的需要, 这一重要的研究成果并没有抢先公布。一年后, 两名加拿大科学家迪克松(G.H.Dixon)和沃德洛(A.C.Wardlaw)通过实验获得了只有天然物 1%~2%生物活性的合成产物, 他们的实验结果比邹承鲁等人的工作差很多, 但是却已经抢先公布了。1960年, 在全国第一次生化学术会议上, 杜雨苍、邹承鲁做了相关的学术报告, 并得到了国内外同行的认可, 因此这套重组方法, 又被称之为“杜–邹法”。

这一系列前期研究的成功给科研人员提出了明确的研究思路: 那就是先分别合成 A 链和 B 链, 然后用合成的 A 链或者是 B 链分别与天然的 B 链或者是 A 链组合形成半合成胰岛素, 最后再利用合成的 A 链与合成的 B 链完成胰岛素的全合成。

协作科研攻关

客观来说, 依据我国当时的科研条件, 仅仅依靠生化所进行单打独斗是难以顺利完成任务的。从研究伊始, 我们就需要有一种团结合作的精神, 如果没有这些单位的诸多科研工作者的合力, 是根本无法在短时间内对胰岛素的结构进行全合成的。特别是在当时的环境下, 有多个领导小组的专家在各个合作单位之间进行协调, 无论是研究思路上的统一意见, 实验操作上的指导, 抑或是实验步骤的完善, 都进行了通力合作, 这也是获得人工全合成结晶牛胰岛素突破的重要基础。

研究伊始, 生化所想到可以和北京大学合作, 让北京大学利用自己的学科优势来承担其中一部分的工作。1953年3月, 曹天钦、钮经义、邹承鲁、鲁子贤、王芷涯 5 人来到北京大学, 开始寻求与北京大学的合作。在北京大学, 生化所的专家做了有关胰岛素研究的学术报告, 北京大学的研究人员给予了积极的响应,决定配合生化所共同开展研究, 承担胰岛素中 A 链的合成任务。

要合成胰岛素, 首先必须要有充足的原料供应。1959年前后, 合成胰岛素的基本原料——氨基酸大部分都是依靠进口, 面对这种情况和高需求量的氨基酸原料, 生化所抽调了陈远聪等人创办了我国第一个专门生产氨基酸的工厂——东风生化试剂厂, 解了燃眉之急。

有了充足的供应之后, 如何进行合成也是一个摆在眼前的最为棘手的问题。我们知道, 胰岛素的合成是一个复杂的系统工程, 这是一个有 A、B 两条链共 51个氨基酸, 需要经过 200 多步化学反应才能合成的,具有生物活性的蛋白质。

有了原料之后, 就开始进行肽链的合成连接。1960年, 北京大学、复旦大学、生化所、有机所等部门几百人开展了轰轰烈烈的科研群众运动, 又被称之为大兵团作战。

1960—1963年, 在已经取得的研究成果的基础上, 虽然一直继续前行, 但是效果不佳, 始终没有突破性的进展。

1963年之后, 国家经济形势出现好转。各项科研工作又逐步步入正轨, 1963年10月, 有机所所长汪猷来北京参加人大会议, 北京大学教研室主任邢其毅邀请他到学校做学术报告, 一起商讨了合作的事宜, 双方经过充分的讨论决定, 由北京大学合成 A 链的前 9 肽, 有机所合成 A 链的后 12 肽。

这个时候, 出现了一个非常现实的问题, 由于北京大学地处北京, 有机所在上海, 当时的通讯方式还不是特别的发达, 要进行联合研究的话, 最好是在同一个城市, 这样才能有效地进行实验的沟通和交流。面对这样的情况, 就必须有一方的工作人员要克服生活、家庭、工作等方面的困难, 整体转移到另外一座城市进行研究。北京大学化学系的老师们从祖国的利益出发, 决定前往上海, 与有机所的科研人员一起协同攻关。在计划经济时代, 物资极度匮乏, 北京大学的汤卡罗回忆说: “他们(指有机所)说, 你们没有上海户口,如果过来, 会既没有肉票又没有肥皂票, 在上海生活会有困难。但是北大表示, 这些困难我们都能克服。肉我们可以不吃, 肥皂我们可以背过去。”试想一下, 北京大学有机教研室的科研人员如果不只身南下, 本可以留在北京大学可以继续从事研究, 建设自己的实验室, 并且可以兼顾到当时的教学和科研任务。但是为了国家的利益和方便实验中的随时交流, 他们做出了巨大的牺牲。

随后, 在国防科工委主任聂荣臻和北京市、上海市领导的支持下, 决定从北京大学抽调季爱雪、陆德培、李崇熙、施溥涛、叶蕴华等 5 名青年教师, 在有机教研室主任邢其毅教授和副主任任文重老师的带领下来到有机所共同进行 A 链的合成, 后来邢其毅的研究生汤卡罗也加入了进来。而生化所就承担了 B 链的合成任务, 以及 A、B 链的拆分和合成研究。

这样, 两个合成队伍都集中到了上海, 方便进行学术上的讨论和交流, 大大提高了工作效率。

1963年, 研究总算迎来了突破性的进展。由邹承鲁领导的研究小组将天然胰岛素 A、B 链重组生成胰岛素的产率从原先的不足 10%提高到 50%左右, 这对于后续的研究是一个重大的利好消息。

1964年, 钮经义、龚岳亭领导的多肽合成组完成了人工合成 B 链, 并且利用人工合成的 B 链与天然的A 链进行重组获得了成功, 这证明了人工合成的 B 链具有生物活性。这时候, 就是等待另外一条链——A链的人工合成完成了。A 链虽然比 B 链要短一些, 但是在合成的过程中出现了很多意想不到的困难, 如人工合成的 A 链在与天然胰岛素 B 链组合之后, 所得到的胰岛素的活力只有天然胰岛素的 1%~4%, 这样的生物活性是很难与已经人工合成的 B 链进行融合的。

按照之前的分工, 生化所负责 B 链的人工合成和 A、B 链的组合。但当 B 链的人工合成完成时, A 链还没有达到预期的目标。这时候, 整个团队协调的作用又体现了出来, 统一的协作组就安排生化所的工作人员与北京大学和有机所的 A 链合成团队, 共同攻克难关。

A 链的合成实验始终在紧张地进行着, 北京大学的陆德培和有机所的徐杰诚在汪猷的指导下进行实验。玻璃滴管的头拉得很细, 以便于精确调节溶液的 pH 值, 再根据精细 pH 试纸的颜色变化进行讨论, 是否需要调节溶液的酸碱度。最终, 在汪猷和邢其毅领导下的联合研究小组实现了 A 链的合成。

当时, 北京大学研究小组的汤卡罗在自己的回忆文章中还特地提到了这种我们视为珍宝的“团队协作”的精神。作为北京大学研究小组负责人邢其毅教授的研究生, 她也有幸加入到当时攻关 A 链合成的队伍中去。为了研究的方便, 邢其毅让她选择了相对独立的课题“牛胰岛素 A 链带保护基的氨端九肽的合成”, 将自己合成的 A 链氨端前 4 肽 A1–4 和后 5 肽 A5–9, 用叠氮法缩合成 9 肽, 结果和其他同事用 DCC 法合成的 9肽性质完全一样, 而且收率还得以提高。

后期研究冲刺阶段的工作非常紧张, 在学术上也经常出现一些争执, 如在合成路径上出现了不同意见,双方都觉得自己的方案更加合适, 就会坚持己见。这个时候, 有机所的党委书记丁公量就会和生化所的书记王芷涯相互交换意见。丁公量的工作作风细致, 从思想工作入手, 深入群众, 兼听则明, 鼓励大家继续发扬这种合作的精神, 求是务实, 充分讨论, 在保证积极合作的前提下选择最优的方案。整个协作研究的过程, 林其谁院士和李伯良研究员将其分为两个阶段: 一个是在 1960年10月生化所与有机所之间的协作组协调; 另一个是 1964年2月生化所、有机所与北京大学化学系的协作组协调。

最终, 在 30 多位实验工作人员的辛苦工作下, A 链终于成功地被合成出来。在 A 链合成的结果拿到之后, 将进行整个全合成中最关键的一步: 与 B 链进行重组。由施溥涛代表北京大学, 张伟君代表有机所, 杜雨苍代表生化所进行实验, 其他科研人员就在实验室外静静地等待结果。

实验的结果是令人振奋的! 通过纯化得到了和天然胰岛素完全相同的比活性和抗原性的人工牛胰岛素结晶。

为了实验结果的权威性和可靠性, 全合成的实验一共重复进行了 4 次, 以保证整个实验结果的可重复性, 结果每一次的实验都成功得到了与天然胰岛素相同的结晶。在纸层析与纸电泳谱上与天然胰岛素也处于同一个位置, 这样就表明全合成产物与天然牛胰岛素结晶是同一种物质。随后为了证明它具有生物活性,化学工业部上海医药工业研究所根据实验结果, 做了《合成胰岛素惊厥法测定结果》的报告, 充分证明人工合成的胰岛素与天然的牛胰岛素具有同等的生物学活力, 至此说明了整个合成的过程获得了圆满的成功。

人工合成结晶牛胰岛素的成功, 第一次证实了二硫键的形成具有高选择性, 也同样以实验证明了蛋白质的高级结构是取决于一级结构的!

这一实验结果的取得是令人欢欣鼓舞的。胰岛素的合成是多个单位通力合作、共同努力的结果。生化所的钮经义和龚岳亭负责胰岛素 B 链的合成, 有机所的汪猷和北京大学邢其毅领导的小组共同负责胰岛素A链的合成, 中国科学院生物物理所邹承鲁带领的团队则负责两条肽链的组合。

在整个牛胰岛素结晶的合成过程中, 牵涉到生化所、有机所、北京大学这 3个地处两地的主要合作单位, 还包括 30 多人的核心攻关力量, 以及近百人的辅助研究力量。这样一个人数众多的研究组, 团结协作显得尤为重要, 所以特地成立了一个专业的协作组, 由王应睐任组长, 汪猷任副组长, 对 3个单位的工作人员进行统筹安排和领导, 最大限度地优化分工合作。

成果发表

1965年, 《科学通报》刊登了一篇文章, 报道了结晶牛胰岛素的全合成过程。在文章的作者一栏详细列出了当时作出贡献的多位科研工作者, 其中有: 中国科学院生化所的龚岳亭、杜雨苍、黄惟德、陈常庆、葛麟俊、胡世全、蒋荣庆、朱尚权、钮经义, 中国科学院有机所的徐杰诚、张伟君、陈玲玲、李鸿绪、汪猷, 北京大学化学系的陆德培、季爱雪、李崇熙、施溥涛、叶蕴华、汤卡罗、邢其毅。

事实上, 北京大学化学系、有机所和生化所 3个单位前期投入研究的成员有上百人之多, 有很多人参与到前期胰岛素 A 链或者 B 链的片段合成工作中, 在最终的文章署名中并没有体现, 但是这依旧不能改变他们的贡献, 他们是一群默默付出的无名英雄。

人工合成牛胰岛素的成功证明了我们的科研实力, 这也是世界上第一个人工合成的蛋白质, 是人类生命科学研究中的一大进步。面对这样重大的研究成果, 中国科学家还是保持了严谨的学术态度, 没有急着发表科研论文, 而是多次举行了严格的鉴定会。杜雨苍、钮经义、汪猷等人进行反复合成, 并用电泳、层析、酶解图谱和免疫性的方法, 对其物理、化学、生物性质进行了长时间的检测, 所有的结果都表明人工合成的产物与天然产物相同。

1966年4月在波兰华沙, 王应睐、邹承鲁、龚岳亭参加了欧洲生化学会联合会, 在大会上宣读了这项成果, 受到各个与会国家的祝贺, Science 杂志则评论我国胰岛素的全合成是蛋白质合成领域中由量到质的转变。

虽然这一合成工作已经过去了 50 余年, 但是这些科研机构工作者排除万难、通力合作的精神为我们留下了一笔宝贵的精神财富, 在人才培养、学术交流、产品研发等方面都起到了极其重要的作用。

人工合成牛胰岛素的团队是由多个单位共同参与, 其中发挥主要作用的是生化所、有机所和北京大学3个单位。论文署名了 21 位学者, 而幕后还有很多位默默奉献的科学家, 他们都成为我国未来生命科学发展的骨干力量。这项研究适应国家最高战略目标和意识形态的需求, 在学术上标志着人类在探索生命的历程中迈出了关键的一步, 客观上证实了化学合成生物大分子的可能性, 也促进了当时生命科学, 尤其是结构生物学的研究进程。