玉米种子纯度鉴定方法及应用实践

□文/刘国栋 赵育进 于秀林 贺海员

随着国家对粮食安全的重视，为了保证农业精量播种的用种安全，国家推出新的农作物质量标准已在2021年11月份正式颁布并实施，精量播种对纯度要求已提升到97%，可见玉米种子纯度在生产应用中的重要性。玉米种子在田间生产过程中，由于隔离区不符合要求，去杂不严格，去雄不彻底，在收获、运输、晾晒、加工过程中，各环节把控不严，都有可能造成种子纯度不高，严重影响玉米种子的产量优势。因此，种子在加工销售前必须进行纯度鉴定，以确保种子使用安全。以下，就玉米种子纯度鉴定方法及在实际中的应用，做一分析：

一、玉米种子纯度的鉴定方法

玉米种子繁育类型通常被分成四种类型，分别是常规种、自交系、单交种、双交及三交种，其纯度标准均不一样。农户用于生产粮食的良种基本都属于单交种，因此，我们针对单交种的纯度检验进行分析讨论。

按鉴定途径一般把鉴定方法分为两种，第一种是室内检验方法，具体细分为盐溶蛋白电泳鉴定和SSR 分子标记鉴定方法，第二种是田间种植鉴定，具体分为海南小区种植鉴定和同季跟踪验证鉴定，但两者鉴定方法除时间和种植区域不同外，无本质区别。

（一）室内鉴定方法投入成本少，判断鉴定快，因此得到广大企业的广泛应用，室内鉴定的两种方法也各有利弊。

1.盐溶蛋白电泳鉴定：此方法是2001年农业部推荐性标准，适用于玉米单交种和亲本种子纯度检测。杂交种检测结果与田间种植结果存在一定偏差，因此，需要通过回归方程来校正数据。

2.SSR 分子标记鉴定：主要应用于育种中的遗传图谱构建及基因定位，现期，玉米品种审定都需要进行分子标记鉴定来区分种子的唯一性。

（二）种植鉴定方法投入管理成本及费用成本比较高，但为了及时准确验证种子田间性状及纯度情况，一般采用海南小区种植鉴定。

1.结果判定的影响因素：由于种植鉴定是在室外农田进行播种并进行跟踪调查，播种时整地情况十分重要，播种的深浅和周围有无阳光遮挡物都会影响鉴定的准确性.因此，必须保证鉴定田播种地块通风透光一致，播种整地整齐一致，施肥中耕管理一致。

2.判定的时期和标准：玉米种子在一季生长过程中，不同生育时期表现出来的品种特性各不相同，所以，需要在不同生育时期进行调查判定，但一般品种主要在授粉期各性状差异显著。差异的分类主要有根系的特征特性，茎秆及节间的特征特性，叶片的生长特征类型，花丝及花药的特殊特性等。

判定时期：主要分为苗期、拔节期、授粉期、结实期四个判定时期。但性状表现最明显的时期是开花授粉期。

判定标准：一般通过株高，株型，雄穗分枝特征，花丝、花药颜色，果穗外型及籽粒类型等来区分判定。

二、室内鉴定纯度在实际应用中的分析

室内鉴定主要方法是盐溶蛋白鉴定方法，其投入成本低，也是注册3000万种子公司的基本检测要求。因为该方法检测不仅具有稳定性及重演性强、分辨率高，且操作简单、检测速度快等特点，因此，该方法在农业生产中得到大力的推广和应用，种子市场也出现了专职的此类检验机构，但此方法检测也存在一定的检测局限性，同时，该判定标准需要进一步的完善修正。盐溶蛋白鉴定纯度结果的分析：

（一）盐溶蛋白鉴定判断自交和杂粒的差异

盐溶蛋白鉴定是通过对蛋白组合的差异来进行杂交种的分类判定，种子自交判定依据是没有在互补带位置出现父母本共有谱带，是谱带的缺失，可以直接判断出来，其田间表现差异非常明显，田间产量差异也比较悬殊。谱带位置不一致则判定其为杂粒，一般存在谱带多带现象，但并不能代表其田间表现差异，我们鉴定纯度的意义在于保证种子田间生产的安全性，有些蛋白基因存在差异只是影响种子的硬壳颜色等细小田间性状，并不影响作物的田间生成的整齐性及生育期等生理特征。

（二）结果判定的回归方程应用

盐溶蛋白纯度鉴定要利用回归方程，Y=52.9+0.461X（Y 是纯度值，X 是电泳值）。因此，种子纯度值并不直接等于电泳判定值，它们之间存在一定的相关性。当电泳鉴定结果为93.5%时，其校正纯度值为96%，刚好达到种子的纯度质量标准最低要求。为了使结果准确可靠，检测样品量必须符合4n 原则，n=1/（1-96%）。因此，鉴定种子纯度不仅与取样代表性有关，其检测量也必须达到最低标准要求。一般检测杂交种的种子纯度，其要求纯度最低是96%，据4n原则，检测种子样品量必须达到100 粒。因此，检测亲本种子纯度，其要求纯度标准是98%时，据4n原则，检测种子样品量必须达到200 粒，标准是99%时，检测种子样品量必须达到400 粒，且质量标准要求为98%以上时，一般不采用回归方程。

三、小区种植鉴定在实际应用中的分析

一般海南小区种植鉴定在生产过程中意义重大，对于自交系品种可以提前准确判定纯度，保证田间制种安全。对于杂交种室内鉴定无法判断的或存在问题的批次，进行海南小区种植鉴定，可以准确判定杂交种的大田生产使用安全。

而同季播种小区种子鉴定，主要是判定田间性状与室内检测结果的一致性，主要针对不容易判定结果的谱带类型，相对海南小区鉴定成本较低，同时，全程跟踪种子各时期差异性状的记录调查。

四、盐溶蛋白鉴定法在应用中存在的问题

大部分种子室内检测结果和田间表现一致，但有些特殊品种其表现存在差异，需要特殊记录识别和区分。

（一）鉴定标准与田间表现的差异

我们鉴定的杂交种，必须保证其亲本种子的遗传性状稳定，因为提取的可识别盐溶蛋白只是品种基因表达的一部分，有些品种室内鉴定并不能完全识别田间差异。比如，鉴定的某一品种类型，室内鉴定谱带整齐一致，但田间表现为严重的株高穗位两极分化，此类玉米主要是由于亲本遗传性状尚不稳定，存在一定的生产安全；还有一种类型，室内鉴定谱带存在两到三种类型，但田间表现却为整齐一致，此类玉米主要是由于亲本自交代数不够，导致二代田间性状分离，也存在一定的生产质量安全。

（二）盐溶蛋白鉴定的操作手法及注意事项

1.磨样及提取：种子样品磨碎时，一定要防止样品间的交叉污染。现期，主要的磨样工具是电动单籽粒粉碎器，使用时，每个籽粒研磨结束，用毛刷或洗耳球清理设备上籽粒样品的残余。用于接样品的纸必须保证表面光滑，每次接样后轻弹接样纸确保上一样品清理干净。样品提取时，提取液放置量一定要一致，保证提取蛋白量一致，对于样品倒入离心管时有样品出现散失现象的，一定要放弃该籽粒样品，因样品中可能缺失种胚物质，对最终判定造成影响。当样品水分高时，可放于40℃条件下进行烘干1～2小时。

2.配药及制板：配药要严格按照标准要求进行精量称取，配好药液要放于冰箱低温中冷藏，保证制板的凝胶效果，一般分离胶可放置10 天，浓缩胶可放置5 天。封底缝操作要快，因其氧化剂放置量是正常胶片的两倍，凝胶速度特别快，低缝封闭完，一定要用滤纸吸附胶面上的水，以保证灌胶时胶面的连续性。

3.点样及清洗：重点注意事项是点样量在样品槽内的高度。量大导致样品量向两侧溢出，导致样品混杂，量少时，灌电极缓冲液时容易形成中空不连续液面，无法电泳。且每点完一粒样品，必须在蒸馏水中清选针管2～3次。

4.电泳：主要是电泳槽正负极与连线千万别颠倒了，否则样品逆向移动。电泳使用稳压设备，电压控制在500 伏，电流会在不同时间段发生变化，一般电泳控制在40分钟左右，以电泳指示剂移动位置、指示剂接近槽底为宜，千万不能越过地面，造成部分蛋白涌出胶面，无法识别。

5.洗板：电泳结束后，倒出电极液，迅速放置冷水中进行卸板，这样操作可以快速完整的分离出胶片，不至于黏连胶板，造成胶片无法剥离或破损。

6.染色：一般染色可放置在常温下染色一晚上，不耽误其它操作，又能达到染色分辨效果，如果要求鉴定结果比较着急，可将胶片放于40℃环境下，染色1～2小时即可达到染色效果。

7.判定：判定依据相关要求标准进行即可。但由于品种类型不同，判定不同品种需要依靠鉴定不同品种的经验积累，也就是除了回归方程的利用，还要结合田间种植鉴定，参照田间种植鉴定进行综合判定。

综上，种子的纯度鉴定，要结合实际应用来选择合适的方法，室内试验判定要结合田间种植鉴定结果来参考。总之，纯度鉴定其操作方法要标准统一，判断依据要特征显著，室内判定要结合室外田间表现来综合判断。