７个桑树ＡＰ２／ＥＲＦ转录因子的生物信息学及表达分析

董亚茹 李茹霞 赵东晓 耿兵 孙景诗 李云芝 王照红

摘要：AP2/ERF类转录因子是植物所特有的一类转录因子家族，在植物的生长发育及响应非生物胁迫中发挥着重要作用。为发掘桑树AP2/ERF类转录因子的成员及其功能，从桂桑优12中克隆到7个AP2/ERF转录因子，命名为MnAP2/ERF1～MnAP2/ERF7。生物信息学分析结果表明，这7个AP2/ERF蛋白都属于不稳定蛋白，且均属于亲水性蛋白，二级结构以无规则卷曲为主，亚细胞定位显示主要位于细胞核中。氨基酸序列比对及进化树分析发现，这7个AP2/ERF转录因子均含有1个保守AP2结构域，其中MnAP2/ERF1～MnAP2/ERF4属于ERF亚家族，MnAP2/ERF5～MnAP2/ERF7属于DREB亚家族。荧光定量分析显示，NaCl、PEG6000、水淹胁迫可诱导7个桑树AP2/ERF基因上调表达，其中MnAP2/ERF3、MnAP2/ERF5、MnAP2/ERF6分别响应水淹、干旱和盐胁迫，说明桑树AP2/ERF转录因子的表达与逆境胁迫响应之间有密切的联系。本研究结果可为进一步揭示AP2/ERF转录因子调控桑树生长发育及逆境胁迫的机理奠定基础。

关键词：桑树;AP2/ERF转录因子;生物信息学分析;基因表达;非生物胁迫

中图分类号：S888.3：Q786文献标识号：A文章编号：1001-4942（2022）01-0007-07

植物的生长发育经常遭受干旱、盐、冷、热等非生物胁迫[1，2]，响应这些胁迫的过程受到多种转录因子的调控[3]。转录因子作为一类重要的调控蛋白，在植物发育和适应环境胁迫的信号通路和网络调控中发挥着重要作用[4，5]。

AP2/ERF （APETALA2/ethyleneresponsivefactor，AP2/ERF）家族是最重要的植物转录因子之一，至少包含一个AP2高度保守的DNA结合域，由60～70个保守氨基酸组成[6]。AP2/ERF家族除了At4g13040外，又可根据AP2结构域的序列相似性和重复程度分为AP2、ERF和RAV家族[7]，其中，AP2家族蛋白有两个AP2结构域，ERF家族蛋白只有一个AP2结构域，RAV家族成员有一个AP2结构域和一个特异的B3DNA结合结构域[8]。根据AP2结构域的序列相似性，ERF家族又进一步细分为ERF和DREB两个亚家族，ERF亚家族的第14和19个氨基酸分别为丙氨酸（Ala）和天冬氨酸（Asp），而DREB亚家族分别为缬氨酸（Val）和谷氨酸（Glu）[9]。

AP2/ERF转录因子对植物的生长发育以及多种逆境胁迫应答反应有着重要调控作用。从大豆中克隆的GmERF3异源性表达增强了烟草对盐和干旱胁迫的耐受性[10];从甘薯中分离出的IbERF1和IbERF2基因对不同的非生物胁迫表现出不同的响应[11];过表达AtERF1的拟南芥株系更能耐受盐和干旱胁迫[12];花生AhERF019基因在拟南芥中过表达可以提高拟南芥的抗旱和耐盐性[13];将罂粟中的PsAP2基因在烟草中过表达可以增强烟草对非生物胁迫的耐受性[14]。

桑树（MorusbalbaL.）在我国分布广泛，是家蚕的唯一植物性食物，具有重要的经济和生态价值[15，16]。目前从桑树中共鉴定到116个AP2/ERF转录因子家族成员[17]，但对其具体功能的研究还比较少。故本研究对从桂桑优12中克隆获得的7个AP2/ERF转录因子进行生物信息学分析，并分析不同逆境胁迫下其在桑树不同组织中的表达特征，以期为进一步研究桑树AP2/ERF转录因子参与逆境胁迫等过程奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试桑树品种为桂桑优12，种子购于广西蚕业技术推广总站。挑选健康、饱满的种子，播种于10cm×10cm×9cm育苗盆中，培养基质为按2∶1比例混合的草炭土和蛭石，于山东省蚕业研究所温室大棚内，在光周期14h/10h、温度25℃、相对湿度60% ～70%条件下培养，至四叶一心期间苗，每盆留苗4棵。播種两个月后，挑选72盆长势基本一致的桑树幼苗，分为3组，每组24盆，第一组和第二组分别用200mmol/LNaCl、20%PEG6000溶液进行浇灌处理，第三组进行水淹处理（以水淹没茎部1cm为准），均设3个重复。于处理0、12、24、48h分别取桑树植株的根和叶，经液氮速冻后保存于-80℃冰箱备用。

1.2 试验方法

1.2.1 桑树AP2/ERF蛋白的生物信息学分析 基于川桑基因组数据库和桂桑优12转录组数据获得7条AP2/ERF转录因子序列，利用ProtParam tool（https：//web.expasy.org/protparam/）在线网站分析其理化性质，利用https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html在线网站分析其二级结构，利用BioEdit软件进行氨基酸序列比对，利用SoftBerryProtComp9.0和WoLFPSORT软件进行亚细胞定位，利用MEGA7.0软件构建系统进化树。

1.2.2 桑树AP2/ERF基因表达分析 用OMEGA植物RNA试剂盒（R6827）提取桑树不同组织总RNA，分别取1μg总RNA进行反转录，反应体系和操作程序参照TaKaRa反转录试剂盒（RR047A）说明。将反转录产物稀释10倍，选择MnRPL15和β-actin作为内参基因[18，19]，进行定量RT-PCR，引物见表1，由上海生工生物工程有限公司合成。RT-PCR反应体系为20μL：TB GreenPremixExTaq10μL，基因特异性上下游引物各1μL（10μmol/L），模板cDNA2μL，补ddH2O至20 μL。反应程序按照TB GreenPremixExTaq（TaKaRaNo.RR820Q）说明书进行，在CFX96RealTimePCRDetectionSystem仪器（BioRadBio.CA.USA.）上完成。每个样品进行3次重复试验，RT-PCR数据利用2-△△Ct法进行分析。

2 结果与分析

2.1 7个桑树AP2/ERF蛋白的生物信息学分析

结果（表2）显示，7个桑树AP2/ERF蛋白的编码区长度分别为588、1050、828、1008、1173、963、477bp，分别编码195、349、275、335、390、320、158个氨基酸。7个MnAP2/ERF蛋白都属于不稳定蛋白，且均属于亲水性蛋白，其中MnAP2/ERF1、MnAP2/ERF5、MnAP2/ERF6蛋白的PI值大于7，为碱性蛋白，其余则为酸性蛋白。对其二级结构进行预测，结果（表3）表明这7个AP2/ERF蛋白的二级结构以无规则卷曲为主，均在50%以上，其次是α-螺旋，在20%以上，β-转角占比最少，均在6%以下。氨基酸序列比对发现，桑树这7个AP2/ERF蛋白均含有1个AP2保守结构域（图1）。

2.2 7个桑树AP2/ERF蛋白的亚细胞定位

利用SoftBerryProtComp9.0软件预测的亚细胞定位结果（表4）显示，MnAP2/ERF1～MnAP2/ERF7均为定位在细胞核的预测值最高（总分10分，数值越高可信度越大）。而利用WoLFPSORT软件进行的亚细胞定位预测则将MnAP2/ERF3定位到叶绿体，其余均与SoftBerryProtComp9.0软件的预测结果一致。综合两种预测结果，考虑MnAP2/ERF1～MnAP2/ERF7可能位于细胞核。

2.3 7个桑树AP2/ERF蛋白的进化分析

为了明确桑树AP2/ERF转录因子家族之间的进化关系，用得到的7个桑树AP2/ERF蛋白序列与26个拟南芥AP2/ERF蛋白序列构建系统进化树，结果（图2）显示，MnAP2/ERF1和MnAP2/ERF2、MnAP2/ERF3、MnAP2/ERF4分别属于ERF亚家族的B3、B2、B4，MnAP2/ERF5和MnAP2/ERF6、MnAP2/ERF7分别属于DREB亚家族的A6、A5。

2.4 7个桑树AP2/ERF基因在不同逆境胁迫下的表达特征

结果（图3）显示，NaCl、干旱和水淹胁迫均能诱导7个MnAP2/ERF基因上调表达，但不同胁迫处理不同时间的表达量有所不同。

NaCl胁迫下，MnAP2/ERF1～ MnAP2/ERF7基因在叶片中的表达量整体高于根系中，其中MnAP2/ERF6基因在叶片中的表达量升高最明显，在胁迫12h达到最大值，24h略有下调，48h则显著下调;MnAP2/ERF1～MnAP2/ERF5均在胁迫24h表达量较高。根系中MnAP2/ERF3、MnAP2/ERF4、MnAP2/ERF5三个基因分别在12、12、48h表达量达到最高值，明显高于其它时期各基因的表达量。

PEG6000胁迫下，MnAP2/ERF基因在叶片中的表达量也多高于在根系中的。叶片中MnAP2/ERF1、MnAP2/ERF2、MnAP2/ERF4均在胁迫48h表达量大幅上调;MnAP2/ERF5基因在胁迫24h表达量大幅升高，但在48h又急剧下调;MnAP2/ERF6在胁迫后即急剧上调表达，12～48h的表达量差异不显著。根系中MnAP2/ERF4基因在整个处理期的表达量也较高，明显高于其他6个基因的表达量。

与盐胁迫和干旱胁迫不同，水淹胁迫下MnAP2/ERFs基因的最高表达量出现在根系中。根系中MnAP2/ERF3基因在水淹胁迫12h的表达量大幅升高，一直持续到48h，高于其它MnAP2/ERF基因。叶片中MnAP2/ERF4基因在胁迫24h的表达量明显高于其它时期各基因的表达量。

3 讨论

转录因子包含DNA结合区、核定位信号、蛋白质相互作用和转录调控等区域，具有相似保守基序的转录因子可能具有相似的功能[20]。本研究从桑树转录组数据库中共筛选到7条完整的AP2/ERF家族蛋白序列，其中4个为ERF亚家族成员、3个为DREB亚家族成员，聚类结果与拟南芥的相似，说明AP2/ERF家族在不同物种间高度保守。这7个桑树AP2/ERF蛋白的编码区长度、氨基酸数目、理论等电点等方面存在差异，可能决定了各蛋白执行着不同的生物学功能。亚细胞定位预测将桑树AP2/ERF蛋白定位于细胞核上，说明是在细胞核中对下游基因进行转录调控。

ERF转录因子是植物中参与非生物胁迫反应的重要候选因子[21，22]。AP2/ERF已被报道是拟南芥、水稻、大豆、苹果和黄瓜等多种植物中的胁迫调节因子[23]。本研究结果也表明，NaCl、干旱和水淹胁迫均能诱导7个MnAP2/ERF基因上调表达，但不同胁迫不同时间在叶片和根中的表达量不同，NaCl和干旱胁迫下在叶片中的表达量更高，而水淹胁迫下在根系中的表达量更高。NaCl胁迫下，MnAP2/ERF6在胁迫12～24h的叶片中表达量较高，其次为MnAP2/ERF4，根系中则以胁迫12hMnAP2/ERF3、MnAP2/ERF4和48hMnAP2/ERF5的表达量较高;PEG胁迫下桑树叶中的MnAP2/ERF4、MnAP2/ERF5、MnAP2/ERF6和根中的MnAP2/ERF4表达量变化较为突出。说明大多数基因表现出特定的时空表达模式，具有潜在的耐盐、耐旱能力，与在杨树、烟草、水稻、番茄、拟南芥中的研究结果类似[24-28]。植物为适应水淹时的缺氧环境，其自身通过多种基因调控以减少损伤[28，29]，淹水胁迫显著诱导ERF基因表达，说明其可能参与了缺氧反应基因的激活[29，30]。本研究中，水淹胁迫下桑树叶中的MnAP2/ERF4、MnAP2/ERF6和根中的MnAP2/ERF3表达量优于其它基因，也说明了ERF基因具有潜在的耐水淹胁迫的能力。

4 结论

本研究从桂桑优12中克隆了7個AP2/ER转录因子序列，预测定位于细胞核，其中，MnAP2/ERF1和MnAP2/ERF2、MnAP2/ERF3、MnAP2/EFR4分别属于ERF亚家族的B3、B2、B4，MnAP2/ERF5和MnAP2/ERF6、MnAP2/ERF7分别属于DREB亚家族的A6、A5。NaCl、PEG6000和水淹胁迫均能诱导其上调表达，推测可能参与调控桑树非生物胁迫应答的过程。本研究结果可为进一步揭示桑树AP2/ERF转录因子调控生长发育以及逆境响应等机理提供参考。