利用CRISPR/Cas9建立RBBP4低表达的HepG2，LO2稳定细胞系

杨丽丽 黄常新* 李永强 王聪洁 沈靖 陈艺丹 张嗣玉

原发性肝癌（HCC）是全球发生率排名第五的癌症，也是第三大致死癌症［1］。我国是HCC 的高发国家，且近年来，原发性肝细胞癌的发病率有所增加［2］但人们对这种肿瘤的分子发病机制知之甚少。但对这种肿瘤的分子发病机制却知之甚少。因此，是最关键的挑战之一。视网膜母细胞瘤结合蛋白4（RBBP4）是一种参与肿瘤发生的核蛋白。它是一种WD40 重复的组蛋白伴侣，在体内广泛分布。最近的研究发现，RBBP4 参与了染色质折叠复合物的形成以及组蛋白的乙酰化。肿瘤的起源、进展与RBBP4 的高表达密切相关［3］，RBBP4在宫颈癌、曱状腺癌、乳腺癌等肿瘤中被报道为一种促癌基因［4］，甚至可能影响放疗和化疗的效果［5］。然而，RBBP4 在原发性肝细胞癌中的表达和功能尚未得到研究。由于CRISPR-Cas9 基因组编辑技术的高效性和准确性，它已被广泛用于癌症治疗。CRISPR-Cas9 系统一直被用作癌症建模和治疗探索中最简便、最通用的平台［6］。本研究利用CRISPR/Cas9 系统建立RBBP4 基因靶向敲除系统，为进一步研究RBBP4 在肝细胞癌形成和转移中的作用机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞来源 HEPG2 及LO2 细胞由杭州师范大学附属医院转化医学平台实验室提供及保存。

1.2 主要试剂与仪器 CRISPR/Cas9n 质粒GRNACAS9 快速构建试剂盒（产品编号HS-CR-0015A）购自北京合生基因公司。感受态细菌DH5α 购自上海生工生物工程有限公司。Lipo2000 转染试剂购自Invitrogen公司；DMEM 培养基及FBS 等细胞培养试剂购自宝连生物工程有限公司；兔源RBBP4 抗体，兔源GAPDDH抗体、辣根过氧化物酶标抗兔IgG 由本实验室。PBS、Hoeehst33342 乳氢酶、RPMI-1640、台盼蓝、TRIZOL试剂、TAKARA 逆转录试剂盒、TAKARA 实时荧光定量试剂盒购于杭州泽衡生科公司；氯仿、异丙醇、乙醇由杭州师范大学附属医院转化医学平台提供。96 孔板、6 孔培养板、细胞计数板、EP 管、冻存管购自杭州泽衡生科有限公司；10 μL 枪头、200 μL 枪头、1,000 μL枪头购自美国Axygen 公司；微量移液器、可调式移液器购自德国Eppendorf 公司；剪刀、镊子、烧杯、200 目筛网、量筒购自杭州华东医药有限公司；光学显微镜、倒置荧光生物显微镜及图像分析系统购自尼康仪器（上海）有限公司。基因测序工作及小向导RNA（sgRNA）寡链核苷酸（oligo）DNA 序列由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1.3 实验方法 （1）向导RNA 寡链核苷酸序列的设计应用网站设计一对针对RBBP4 基因第1 个外显子的sgRNA 序列。设计方法如下：①直接输入基因名称RBBP4 提交至网址（https：//chopchop.rc.fas.harvard.edu/），选择sapiens（hg38/grch38）②比对结果，选择一对最优序列，在最优序列正向链的5’端添加ACCG，反向链的5’端添加AAAC，互补gGRNA-CAS9 质粒，见表1。小向导RNA（sgRNA）寡链核苷酸（oligo）DNA序列及后续测序工作均由上海生工生物工程有限公司完成。以下将RBBP4 重组质粒称为RBBP4-HS015A。（2）RBBP4-HS015A 的建立与筛选：HS015A 是一种U6启动子sgRNA 支架表达载体，可表达具有Cas9 D10A 切口酶突变的Cas9n，具有氨苄青霉素（AmpR）和嘌呤霉素抗性（PuroR）。本实验购买的质粒双酶切部分已由上海生工生物工程有限公司完成。oligo1 和oligo2 的磷酸化和退火分别由T4 多聚核苷酸酶进行。使用T4 连接酶将线性HS015A 质粒载体与oligo1 连接，并在室温下将oligo2 退火1 h。将连接产物转化到感受态细菌 trans5a中，并在AmpR Luria-Bertani 培养基平板上筛选。挑选阳性克隆，摇床，送公司测定顺序。测序的引物见表2。测序正确的克隆用康为世纪盒提取重组质粒HS015ARBBP4。（3）转染和转染成功的单克隆细胞的采集：混合Lipo2000 试剂和DMEM，重组质粒HS015A-RBBP4 与DMEM（Gibico）混合，室温放置5 min。染后将Lipo2000试剂和DMEM 混合物与HS015A-RBBP4 合并在一起，室温下放置30 min。分别重悬HEG2 和LO2 细胞，接种于6 孔板上，接种密度为30%～50%，加入前述室温放置的Lipo2000 和DMEM 混合物、HS015A-RBBP4 混合物。转染8 h 后换液，培养2～3 d 后提取细胞蛋白及RNA。（4）Western blot检测RBBP4 的表达：收集野生型HEPG2 和LO2 细胞和转染的显绿色荧光的细胞（见图1），用RIPA 蛋白裂解液使细胞发生裂解，收集全部裂解细胞的提取物，并通过离心取样上清液。用野生型的细胞蛋白作对照。将样品放置于紫外分光光度计中测定计算蛋白浓度，经蛋白变性后调整为相同蛋白浓度，本实验均为5 μg/μL，取等量蛋白样品。进行SDS-PAGE电泳，经半干转印至NC 膜后，5%脱脂牛奶封闭，一抗、二抗孵育，加入曝光底物进行曝光。以GAPDH 为内参，Western bloting 法检测RBBP4 蛋白在细胞中的表达情况，将野生型细胞和RBBP4 敲除细胞中RBBP4 蛋白表达情况进行对比。（5） RT-qPCR 检测RBBP4 的表达：收集野生型细胞和转染的显绿色荧光的细胞，用Trizol 法提取细胞总RNA，去除基因组DNA，再逆转cDNA。设计RBBP4 和GAPDH RT-qPCR 引物，见表3。进行RT-qPCR。GAPDH 作为内参，检测RBBP4 在细胞中的表达情况，比较野生型细胞和RBBP4 敲除细胞中RBBP4 的表达差异。

图1 转染效果图

表1 sgRNA的选择

表2 PCR检测引物

表3 qPCR引物（5’to 3’）基因引物长度（bp）

2 结果

2.1 HS015A-RBBP4 重组质粒基因检测顺序数据显示，在酶切位点之间插入的基因序列、方向及位置与设想中一致，证实oligo1 正确插入HS015A，成功组建重组质粒，见图2。

图2 测序结果比对

2.2 Western blot 检测HS015A-RBBP4 蛋白敲除的效果相比于野生型HEGG2 细胞及LO2 细胞，HS015ARBBP4 细胞内源性RBBP4 蛋白表达量显著下降（P＜0.05），但仍然有低表达。见图3、图4。

图3 Western blot检测HEG2细胞RBBP4蛋白表达水平结果

图4 Western blot检测LO2细胞RBBP4蛋白表达水平结果

2.3 RT-qPCR 检测RBBP4基因表达的变化相比较于野生型细胞，RBBP4 mRNA 表达显著降低（P＜0.05）。见图5。

图5 LO2细胞及HEG2细胞MRNA表达量

3 讨论

RBBP4 的高表达与肿瘤产生、进展息息相关。RBBP4 在原发性甲状腺癌中的表达量显著上升，尤其在非弹性甲状腺癌中表达量更甚。随着RBBP4 的表达量降低后，原发性甲状腺癌的发生也明显受到抑制。RBBP4 在前列腺癌中也是明显上调的，它能促进前列腺癌的侵袭和迁移。研究发现MiR-429在上皮细胞黏附分子阳性的肝癌肿瘤启动细胞（T-ICs）中的富集有助于肝细胞的自我更新、恶性增殖、化疗耐药性和致瘤性。而MiR-429 的表观遗传学修饰可以通过靶向RBBP4/E2F1/Oct4 轴操纵肝脏T-ICs。研究发现BCL11A 在耐化疗的三阴乳腺癌和其他肿瘤群体中都是一个关键基因，RBBP4 是一种组蛋白伴侣蛋白，与许多核心抑制剂复合物共享的组蛋白伴侣。通过RBBP4，BCL11A 能够招募NuRD、PRC2、和SIN3A，以启动转录抑制，揭示了这种相互作用是一个潜在的治疗目标［7］。因此构建稳定敲除RBBP4 基因的肝癌胞系及正常肝细胞系对研究肝癌多发耐药调控基因发生发展机制有重要的意义。

CRISPR/Cas9n 系统是新一代的基因定向编辑技术，是一种高效、廉价和易于使用的基因组编辑工具，它正迅速被应用于许多领域，包括动物模型的生成、基因敲除细胞系、功能性基因组筛选和纠正遗传性紊乱疾病［8］。最近，由于CRISPR-Cas9 基因组编辑技术的高效性和准确性，已被广泛用于癌症治疗的探索中。一些研究使用CRISPR-Cas9 直接针对癌细胞和动物癌症模型中的基因组DNA，将这种分子治疗策略与传统的手术、放疗或化疗结合起来有助于扩大抗癌疗效。在这项研究中，使用CRISPR/Cas9n 系统构建了靶向RBBP4敲低的向导RNA，并连入HS015A 载体，构建RBBP4-HS015A 重组质粒，并将构建成功的质粒转染进HEG2及LO2 细胞系，分别选择嘌呤霉素处理细胞系，分离并扩增单克隆细胞，成功构建了敲低RBBP4 基因的HEPG2 及LO2 的稳定细胞系，一方面通过单向导RNA（sgRNA），Cas9 内切酶可以被精确地引导到目标RBBP4位点，产生DNA 双链断裂（DSBs），从而启动DNA 修复过程，产生引起位点特异度的基因组修饰，避免了RNA 干扰技术（RNAi）普遍不可预知的脱靶效应［9］。本研究利用CRISPR/Cas9 系统建立肝癌RBBP4 基因靶向敲除系统，为进一步研究RBBP4 在肝细胞癌形成和转移中的作用机制提供实验依据。尽管如此，亦有报道指出，有可能使用该技术在小鼠体内诱发癌症以创建肺癌模型［10］。因此在使用CRISPR-Cas9 技术时，必须权衡利弊，谨慎使用。